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萌发种子淀粉酶酶学性质的研究 学院：生命科学学院 班级：生科1301 姓名：张曜宇 学号：萌发种子淀粉酶酶学性质的研究 （东北农业大学，生命科学学院，150030） 摘要：从萌发的小麦种子中通过离心方法提取淀粉酶，采用分光光度计法绘制麦芽糖浓度与吸光度关系的标准曲线，并在此基础上籍由反应生成的还原糖测定萌发小麦种子中淀粉酶的活性。温度、PH值、激活剂、抑制剂可影响酶活性。本实验结果表明，在PH=5.6，T=40℃的条件下，小麦种子中淀粉酶总活性为280.85mg/g·5min ，而α-淀粉酶的活性为5.34mg/g·5min；40℃左右时，酶的活性最高，PH在5.6左右时，酶的活性最大。Cl-使酶的活性增强，Cu2+使酶活性减弱。 关键词：淀粉酶 DNS 酶活性 温度 PH 激活剂 抑制剂 前言：淀粉属于多糖，是植物体储存能量的物质之一。淀粉不能被生物体直接利用，必须把它分解为葡萄糖后，才能被细胞氧化，提供生命所需能量。种子萌发时，生命代谢增强，这需要大量的能量，这时，储存其中的淀粉就起作用了，而淀粉首先得分解，这就需要淀粉酶的催化[1]。按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和麦芽糖酶四种类型。实验证明，当谷类种子萌发时，两类淀粉酶（α，β型）都存在，淀粉酶总酶活性随种子萌发将升高，有利于淀粉被降解为植物生长发育所需的葡萄糖。淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益[2]。通过此次实验研究，能够初步掌握淀粉酶性质的研究方法，学会科学合理地设计实验方案,为以后的研究打下坚实的基础。 1.材料与方法 1.1材料、仪器、试剂 1.1.1材料:由东北农业大学生化实验室提供的萌发的小麦种子(芽长约2~3 cm)。 1.1.2仪器:分光光度计；离心机；两支25mL离心管;台秤；研钵；容量瓶（100ml, 20ml，25ml）；具塞刻度试管；移液管(1ml,2ml,5ml)；恒温水箱(100℃,70℃，40℃);吸耳球;冰箱。 1.1.3主要试剂及配制方法 (1)10g/ml淀粉溶液：称取1.0g淀粉溶于100ml 0.1mol/l 柠檬酸钠缓冲液(pH 5.6)中 (2)0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液： A液：称取一水合柠檬酸21.01 g，用蒸馏水溶解并定容至1L； B液：称取二水合柠檬酸钠29.41 g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 取A液55 mL与B液145 mL混匀，即为pH5.6的缓冲液. (3)DNS-试剂：先配20ml 2mol/L NaOH溶液,称取1 g 3, 5–二硝基水杨酸溶于其中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100 mL.存放时盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入. (4)麦芽糖标准液(1mg/ml)：称取麦芽糖100mg溶于少量蒸馏水中,移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。 (5)0.4mol/L的NaOH溶液:称取1.6g氢氧化钠,溶于100ml水中. (6)0.1mol/L pH3.0的柠檬酸缓冲液:取0.1mol/L柠檬酸溶液18.6ml，与0.1mol/L柠檬酸钠溶液1.4ml混合 （7）0.1mol/L pH8.0的柠檬酸缓冲液:取0.1mol/L柠檬酸溶液0.55，与0.2mol/L磷酸氢二钠溶液19.45ml混合 1.2方法 1.2.1 麦芽糖标准曲线制作 取7支干净的20ml具塞刻度试管，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0.0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml。然后于各瓶加蒸馏水使溶液达2.0ml。再各加入3，5-二硝基水杨酸试剂2.0ml。摇匀后至沸水浴中加热5min，取出后用流水冷却至室温。加蒸馏水定容至20 ml，摇匀。以1号管作为空白调零，用分光光度计在520nm的波长下测定吸光度，以麦芽糖浓度及吸光度关系，绘制麦芽糖标准曲线。 1.2.2 酶液的提取 称取1.0克萌发的小麦种子,于研钵中加2mL蒸馏水和少量石英砂，研磨成匀浆。将匀浆倒入25ml离心管中，加入10ml蒸馏水。混匀后在室温下静置提取15－20分钟，每隔数分钟震荡一次，使其充分提取。放置20分钟后，开始离心（4000rpm/min）10分钟，后将上清液倒入25ml容量瓶中，定容摇匀，即为淀粉酶原液，用于淀粉酶活力测定。 1.2.3 α-淀粉酶活性的测定 用1.2.2中的上清液作酶液，取25mL具塞刻度试管3只，按下表处理。 项目 α-淀粉酶活性的测定 试管号 I－1 I－2 I-3 淀粉酶原液ml 1 1 1 钝化β－淀粉酶 置于70℃水浴15分钟，冷却 酶稀释液ml 0 0 0 pH5.6缓冲液ml 1 1 1 0.4mol氢氧化钠溶液ml 4 0