农杆菌介导的柑转cbf类似基因及检测.pdfVIP

农杆菌介导的柑橘转CBF类似基因及检测 摘要 柑橘是世界第一大果树，在我国果树产业中具有重要的地位。但是，周期性的 冻害严重影响了柑橘的产量和品质，培育抗寒品种是解决该问题的有效途径之一。 然而，柑橘属植物具有多胚性、遗传高度杂合、童期长、雌雄性败育等特点。柑橘 基因工程以及在此基础上的柑橘遗传转化为缩短育种周期、获得抗寒、优质柑橘种 质资源提供了新的途径。 factor)是一 CBF(CRT／DRE(C-repeat／dehydrationresponsiveelement)binding 种调控一系列植物冷驯化相关基因表达的转录因子，在低温诱导下迅速合成，与下 游基因启动子上的CRT／DRE元件结合，促进基因的转录，进而合成糖类、脯氨酸 和膜蛋白等物质，提高植物的抗寒性。基因转化实验证明，CBF基因在拟南芥和油 菜等植物中超表达，使转基因植株的低温耐性显著增强。这一发现为利用基因工程 手段提高植物耐寒性提供了新途径。 本研究的目的是：利用分子生物学手段分别构建枳(Poncirus tabacum L．)，以期揭示柑橘中的CBF低温应答途径，为培育优良的柑橘抗寒新品种 奠定基础。本研究获得的主要结果如下： 与其它植物基因序列比对分析，选择与其它物种中无同源性的一段片段，与空 干涉载体DHRVP同源重组，使得这一片段分别以正向和反向连接于载体上，且 子，后面连接Nos终止子，得到干涉载体。 2．用根癌农杆菌介导的方法，将构建好的4PMVCBFa载体对柠檬(Citruslimon∞．) Burm 鉴定，经鉴定，转基因植株具有较高的再生率和阳性率。 3．对转化Ptcbfa基因超量表达载体的柠檬植株，测定了部分反应抗寒性强弱的指 标。以未转化柠檬植株为对照，测定了转化和对照柠檬植株中，经不同低温处 理后的蔗糖、葡萄糖、果糖、肌醇、苹果酸、柠檬酸等的含量，并测定了两者 檬植株抗寒性有所提高，有望进行下一步的研究。 农杆菌介导的柑橘转CBF类似基因及检测 reticulataBlanco)、烟草进行了遗传转化，并且获得了部分转化植株，有待进一 步的研究。 sinensis 5．克隆了几个不同柑橘品种，橙(CilrusOsbeck)、柚(Citrus grandis Osbeck)、柠檬中的cbjq基因，核苷酸和氨基酸序列比对表明，枳、橙、柚、柠 檬几个品种中的c坍基因存在明显的差异。经RT-PCR实验分析，发现柠檬与 另几个品种c龟，7的表达有很大差异。 6．研究了Ptcbfl基因在枳中的表达特性，发现Ptcbfl基因具有冷诱导表达的特性， 但存在一定的组成型表达，低温诱导时，表达先逐渐增强后又逐渐降低。 7．研究了包括cbjq基因在内的几个冷相关基因，在两个抗寒性不同的柑橘品种(枳 和桠柑)中的低温表达特性，发现这几个基因在枳中对低温反应较在槿柑中要 敏感。在枳中，随着低温处理时间的延长，几个冷相关基因的表达量有明显的 升降趋势，而在桠柑中，表达量变化幅度不是很大。 8．构建了Ptcbfl基因的超量表达载体和RNAi抑制表达载体，分别命名为： 5PMVCBFl、5DHRCBFl。 9．利用根癌农杆菌介导的方法，对柠檬和烟草进行了5PMVCBFl载体的转化；对 化植株。 关键词根癌农杆菌；基因克隆；遗传转化；载体构建；基因表达；RNAi；低温诱 导； Ⅱ 农杆菌介导的柑橘转CBF类似基因及检测 ABSTRACT italso all Citrusranksthenumberoneintheworldfruit holds