苹果bhlh基mdcibhlh1克隆及功能分析.pdfVIP

山东农业大学博士论文 中文摘要 苹果 （Malus domestica B. ）是世界上栽培最广泛的果树之一。提高苹果产量能够缓 解农产品供给压力并且给果农带来更多经济效益。在许多商业苹果栽培地区，低温是限 制苹果产量的主要环境因素之一。本研究筛选得到一个低温响应的苹果嘎啦 （Malus × domestic cv. ‘Royal Gala’ ）基因MdCIbHLH1 ，并通过农杆菌介导的方法将该基因转入苹 果愈伤、烟草、拟南芥以及苹果组培苗中，对MdCIbHLH1基因的功能进行了研究。 1. MdCIbHLH1基因的克隆 根据拟南芥bHLH转录因子序列，在GenBank （ ）已发表 的苹果EST序列中搜索同源序列。通过半定量PCR 的方法筛选到一个低温诱导的苹果 bHLH 转录因子并克隆基因全长，将其命名为MdCIbHLH1 （Cold-Induced bHLH1 ； GenBank accession number ABS50521 ）。 2. MdCIbHLH1序列分析 MdCIbHLH1编码区长1 596 bp ，编码531个氨基酸，分子量为57.4 kD 。序列分析表 明MdCIbHLH1 具有3个内含子。 利用MEGA 4.0 对bHLH 蛋白进行进化树分析。将MdCIbHLH1 和所有的拟南芥 bHLH蛋白进行聚类，发现MdCIbHLH1蛋白与AtbHLH116 （AtICE1 : INDUCER OF CBF3 EXPRESSION1 ）和AtbHLH033 （AtICE2 ）紧密聚在一起。基因组比较分析表明，它们 的基因组结构相似，都含有4个外显子。 3. MdCIbHLH1 的组织表达分析和逆境响应分析 通过定量和半定量PCR对MdCIbHLH1在各组织中的转录水平进行分析。结果表明： MdCIbHLH1 呈组成型表达，在苹果的春梢、休眠芽、花苞、花、幼叶、成熟叶片、幼 果、果皮以及愈伤组织中均检测到该基因的表达。在花苞、盛花、幼梢、幼果等幼嫩器 官中，MdCIbHLH1 的表达受低温诱导。另外，苹果中两个CBF-like基因MdDREB1 和 MdCBF1在这些器官中也受低温诱导。利用半定量PCR检测苹果实生苗中MdCIbHLH1基 因在非生物胁迫条件下的表达情况，结果表明MdCIbHLH1 受低温、盐、ABA 、PEG诱 导上调。同时MdDREB1和MdCBF1 也随着MdCIbHLH1 的上调表达也上调。 4. MdCIbHLH1与拟南芥At CBF3基因的启动子结合 利用EMSA技术检测MdCIbHLH1 蛋白能否特异地结合到拟南芥CBF3 启动子的 1 苹果 bHLH 基因 Md CIbHLH1 克隆及功能分析 MYC识别位点上。在拟南芥中，AtCBF3 的启动子区域有4类MYC识别位点（CANNTG ； MYC1 ，MYC2 ，MYC3(5) 以及MYC4 ）。结果表明MdCIbHLH1蛋白能结合到MYC1-MYC4 识别位点上，竞争能明显减弱MdCIbHLH1蛋白与MYC4 的杂交信号，而突变的竞争探针 不能减弱杂交信号，说明MdCIbHLH1蛋白与AtCBF3 启动子的MYC4位点是特异结合的。 但是竞争对MYC1 、MYC2和MYC3(5)没有作用，说明MdCIbHLH1蛋白与它们的结合作 用是非特异的。 5. 在愈伤组织中过表达MdCIbHLH1基因 我们检测了MdCIbHLH1 基因在活体条件下的功能。将CaMV35S 启动子启动的 MdCIbHLH1-GFP融合基因通过农杆菌介导的方式转入苹果愈伤组织。半定量结果显示： MdCIbHLH1 在转基因愈伤组织中表达水平提高。MbDREB1和MdCBF1表达水平也相应 提高，说明MdCIbHLH1 基因可能在这两个基因的上游调控它们的表达。此外，还鉴定 了转基因对愈伤组织生长的影响。结果表明转基因愈伤组织在低温和盐处理23天后生长 量大于对照愈伤，说明转基因愈伤组织提高了对低温和盐的抗性。 6. MdCIbHLH1蛋白的降解和蛋白质修饰 为了检测MdCIbHLH1-GFP蛋白在低温下的表达水平，我们