铅全抗原的制备铅抗体酶联免疫检测体系的建立.pdfVIP

摘要 摘 要 铅是一种具有高蓄积性、多亲和性的生理性和神经性毒物，各国对食品与 环境中的铅残留量均有严格的限制。铅抗原与铅抗体的制备是建立铅酶联免疫 快速检测试剂盒的基础和关键，本研究运用高度特异性的抗原抗体反应，及免 疫竞争结合原理，采用双功能螯合剂将铅与牛血清白蛋白(BSA)桥接合成全 抗原免疫Balb／c小鼠，对铅抗体的检测方法进行优化，经细胞融合等步骤制备 抗铅单克隆抗体，主要内容如下t 1)铅全抗原的制备 采用双功能螯合剂[(】妁．2．氨基．3．(4．氨基苯基)丙基卜(S．S)环己烷．1，2二乙 三胺五乙酸(P．NH2．Bn．Chx．A-Dtpa)制备重金属铅全抗原，分别用戊二醛法， 重氮化法等方法，将螯合剂与牛血清蛋白(BSA)连接，再将合成的蛋白螯合剂 法与重氮化法得到的人工抗原，蛋白与铅的偶联比分别为l：15．64与l：42．95 (1：42．95抗原为絮状沉淀物免疫效果不佳)。另外，本研究将戊二醛法予以优 化，将戊二醛法制备的蛋白螯合剂复合物与铅离子进行两步螯合得到抗原BSA- P-NH2．Bn．Chx．A-Dtpa．Pb，偶联率提高到1：20以上。 2)铅抗体ELISA检测方法的建立 对间接ELISA检测方法的实验条件进行优化，建立起高效、快捷、方便的 铅抗体ELISA检测方法。在初始操作流程的基础上，对缓冲液种类、缓冲液 Ph值，抗原包被时间，抗原包被温度，等参数进行优化，确定用Ph=7．4的HBS 作为缓冲溶液，包被温度与时间为37℃1h或4℃过夜；通过以上参数的确定， 确定铅抗体的ELISA检测体系。 3)抗铅单克隆抗体的制备与鉴定 将(1)中所制各抗原用于小鼠免疫实验并通过ELISA检验其免疫效果， 免疫程序设计上分别做了50p,g、100lag两个免疫剂量对照，并适当增加了免疫 次数，四免后小鼠效价最高达到l：102400以上，计算不同包被抗原OD值的 差异率达128％，证明小鼠体内产生了针对铅的抗体。 将阳性小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，融合率达86．04％，单克隆孔率达 摘要 40．6％，经过5次亚克隆得到两株特异性与敏感性均较好的细胞株15E8、20C11， 并通过体内诱生法得到的腹水型单抗。 关键词：单克隆抗体；重金属；铅；人工抗原 II ABSTRACT ABSTRACT with and a andnervetoxicant Leadis accumulating Physiological high property theresidual of hascloserestraintson affinities，andeverycountry quantity multiple oflead andlead is leadinfoodandenvironment．The antigen antibody preparation thebasisand tobuild kitfor testing lead—enzymeimmunity．This keypoint upquick researchconsiders and reactionwith