海南长春花小叶病植原体16S rDNA基因片段的比较分析.pdfVIP

维普资讯 第 29卷 第 3期 热 带 作 物 学 报 Vo1．29 No．3 2008年 6月 CHINESE JOURNALOFTROPICAL CROPS Jun．2008 海南长春花小叶病植原体 16SrDNA 基因片段的比较分析 车海彦 刘先宝 符瑞益 叶莎冰 罗大全 海呈南蓥省热紊带农业有害生物检测监嚣控重罴点篓实验蓥室海南儋州571737 摘 要 从海南儋州地区的长春花上采集了表现小叶症状 ，疑似植原体感染的病样，利用植原体 16SrDNA 通用引物对 R16mF2／R16mR1，应用PCR技术从该样品的总DNA提取物中扩增到预期大小的特异片段 (约 l，4kb)， 该片段的序列分析及系统关系树构建的结果表明，该片段与 l6SrI组中的植原体同源率均达到99％以上，而 与其它组的植原体 16SrDNA序列的同源率均低于 96％，与 16SrI组植原体缬草黄化、翠菊黄化、桑萎缩和玉 米丛矮等在同一条进化枝上。故初步认为引起海南长春花小叶病的植原体应归属于 l6SrI组，将其暂命名为 长春花小叶植原体海南株系 (PeriwinklelittleleafphytoplasmastrainHainan，PLL—Hn)。 关键词 长春花小叶病 植原体 16SrDNA 序列分析 中图分类号 $718．87 长春花 (CatharanthusroSelLS)又名五瓣梅，为夹竹桃科长春花属多年生草本植物。不仅是一种可供观 赏的多年生花卉，也是一种重要的南药植物。海南因为气候方面的原因，适宜长春花植株中有效成分的 生成和积累，故长春花在海南的种植面积 比较大，而且有很多天然生长的长春花 。由于在 自然条件下， 长春花很容易感染不同种类的植原体株系，如长春花小叶 、翠菊黄化f3]、长春花黄化植原体 等 。本研 究拟采用分子生物学方法对 田间采集到的表现小叶症状的长春花植株进行植原体 16SrDNA 的测序 ， 明确其分类地位 。现将结果报道如下。 1 材料与方法 1．1 植原体样品的来源 表现小叶症状的样品及健康长春花样品均采 白海南省儋州地区 。 1．2 植物总DNA提取 参照顾沛雯等I5]的方法提取植物样品的总DNA，最后于一20℃冰箱内保存备用。 1．3 PCR扩增、克隆及序列测定 根据 Lee等[6]报道的引物对 Rl6mF2爪l6mRl扩增植原体 16SrDNA基因片段序列。引物对序列如 下：R16mF2：f5一CATGCAAGTCGAACGGA一3)；R16mR1：(5一CTTAACCCCAATCATCGAC一3)。弓I物 由上海英骏生物技术有限公司合成 ，反应条件如下：94℃变性 1min，55℃退火30S，72。C延伸 1．5 min，循环 35次，最后 72℃延伸 15min。以健康长春花植株和无菌双蒸水为对照。 PCR扩增 出的 目标产物 由TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer．2．0纯化 回收，克隆入 pMD18-TSimple载体 中，利用PCR反应和酶切筛选阳性克隆，序列测定委托上海英骏生物技术有限公 司完成 。 1．4 序列分析 利用国际基因数据库 GenBank中的BLAST程序对测序结果进行同源性检索，通过DNAMAN6．0 软件进行同源性比较及系统关系树的构建 。 中国热带农业科学院科技基金项 目(编号：Rky0709)资助 。 车海彦 女，硕士，助理研究员。研究方向：植物病毒学。电话：0898 通‘讯作者 罗大全，E-mail：Luodaquan@163．corn，电话：0898 收稿 日期 ：2008—01一l4 修 回 日期 ：2008—04—22 维普资讯 3期 车海彦等：海南长春花小叶病植原体 16SrDNA基因片段的比较分析