猪细小病毒SC-1株VP2基因的定点突变及其对该基因表达的影响.pdfVIP

维普资讯 中国兽医科学 2008．38(07)：563—568 ChineseVeterinaryScience 中图分类号 ：S852．659．2：Q 786 文献标识码 ：A 文章编号：1673—4696(2008)07—0563—06 猪细小病毒 SC一1株 VP2基因的定点，I、突／＼_变及其 对该基 因表达的影响 胡秋炅，徐志文，郭万柱 ，朱 玲 ，蒋清蓉，王 印，王小玉 (四川农业大学 动物生物技术中心 ，四川 雅安 625014) 摘要 ：根据 GenBank中的猪细小病毒 (PPV)VP2基因序列设计并合成 了2对突变引物，对 PPV SC1 株 VP2基 因进行 了定点突变。利用重叠延伸 PCR技术分别将 VP2蛋 白中第 402位 (A)和 214位(B)的半 胱氨酸突变为精氨酸，并定向克隆入真核表达载体 pPI一2．EGFP中，构建含报告基因EGFP的重组质粒 pPI一 2．EGFP．VP2(A)、pPI一2．EGFP．VP2(B)；利用脂质体介导法将上述重组质粒转染CO 7细胞 ，从而研究该 突变对 VP2基因表达的影响。结果显示，成功构建 了含突变体及 EGFP的真核表达载体；在倒置荧光显微 镜下，突变后的质粒转染呈现不同的荧光信号 ，A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中，而B样品与阳性对照 相似，荧光信号均匀分布于细胞中。提示，突变的引入是导致表达差异的主要原因。 关键词：猪细小病毒 ；VP2基因；定点突变；真核表达 Site_d‘irectedmutationsofVP2geneofporcineparvovirusstrainSC_·1 and itseffectonexpression ofthegene HU Qiu—jiong，XUZhiwen，GUOWan—zhu，ZHU Iing，JIANGQing—rong，WANGYin，WANG Xiaoyu (AnimalBiologa‘l丁 (hnolog (’alCenter，SichHanAgri~ulturalUniversity，Ya’an625014，China) Abstract：Based on theVP2genesequenceofporcineparvovirus(PPV)availablein GenBank，tWO pairsofprimersweredesignedandsynthesizedtomodifyVP2geneofthePPV SC 1strain．Usingoverlap pingextensionPCR ，thecodonsencodingcysteineofVP2proteinin214thand402ndsiteweremutatedinto thecodonsencoding arginine，then themutantVP2 genewas cloned into eukaryotic expression vector pPI一2．EGFP withgreenfluorescentprotein(GFP)genetoconstructtherecombinantplasmidspPI一2．EG FP．VP2(A)andpPI一2．EGFP．VP2(B)．Toelucidatetheeffectofthemutation on theexpression ofthe mutants，theC()S7 cellsweretransfected with the plasmids，via mediation by IIPOFECT10N Reagent 2000．TheresultshowedthattherecombinantplasmidspPI一2．EGFP．VP2(A)and pPI一2．EGFP．VP2(B) wereconstructedsuccessfully．Thegranularenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)inthecellstrans— fectedbypPI一2．EGFP．VP2(A)wasobserved．Thisobservationindicatedthatthemutant