犬细小病毒新抗原变异株VP2基因的克隆与序列分析.pdfVIP

维普资讯 第 25卷 第 1期 实验动物科学 Vo1．25 No．1 2008年 2月 LAB0RAT0RYANIMAL SCIENCE Febmary2008 犬细小病毒新抗原变异株 VP2基 因的克隆与序列分析 刘大伟 杨 敬 范 薇 隋丽华 刘宏伟 邱业峰 王 鹏 赵 爽 孙岩松 (1．军事 医学科学 院实验动物中心 ，北京 100071) (2．军事医学科 学院疾病预防控制所 ，北京 100071) 摘要 ：目的 鉴定犬细小病毒 (Canineparvovirus，CPV)新抗原变异株 的病毒型，为研究 CPV变异及制备 CPV特异性 诊断和治疗试剂奠定基础。方法 从病毒细胞培养物中提取基 因组 DNA，设计合成针对 VP2基 因的 1对特异引 物 ，PCR扩增出VP2基因片段 ，克隆后测序 ，应用 DNAstar进行序列分析。结果 得到 CPV—VP-2基因序列 15份 ，其 中CPV2a10份 ，CPV一2b5份 ；FPV—VP-2基 因 1份 。结论 各序列与已发表 的标准序列 比较 ，同源性在98％以上 ，未 形成 明显分支 。 关键词 ：犬细小病毒 ；VP2基因；序列分析 中图分类号：Q939．44 文献标识码 ：A 文章编号：1006—6179(2008)01—0021—05 犬细小病毒 (Canineparvovirus，CPV)可引起犬 的 1．2 分子生物学试剂 严重 的出血性肠炎 ，是重要 的致病 因子…，1978年 QIAampDNAstoolmini试 剂盒 (DNA提取试剂 最初从美国分离到，并迅速传播到世界各地 ，致许多 盒 ，Qiagen公司)；DNA 回收纯化试剂盒 (TaKaRa公 犬死亡，这个毒株命名为 CPV2型 (CPV一2)，以和非 司)；PCR扩 增 试 剂 (TaKaRa公 司)；MarkerDI2000 致病性 的犬 细 小病毒 和犬微 小病毒进 行 区分。 (TaKaRa公司)。 CPV一2出现后 ，又分离到新 的抗原变异株 CPV一2a型 1．3 病毒 DNA的提取 (CPV一2a)和 CPV一2b型 (CPV一2b)。1985年 ，CPV．2a 病毒基因组 DNA的提取采用 QIAampDNAstool 和 CPV一2b完全取代 了CPV一2。 mini试剂盒 ，方法参照说明书，一20℃冻存备用 。 犬细小病毒病 曾在我国广泛流行 ，经 CPV疫苗 1．4 VP2基 因的 PCR扩增 的应用，CPV的病例大为减少 ，但近年来又有增多的 参照基 因库 CPV．d序列设计上下游 引物 VP2F／ 趋势。原因之一为现在广泛应用 的疫苗为 CPV一2， VP2R，其引物为 ： 而现在 流行毒株 多为抗原变 异株 CPV．2a和 CPV一 上游 ：5CCGGATCCAGAGACAATCTIGCACCA3 2b。本研究从临床病例 中分离鉴定了犬细小病毒抗 下游 ：5CGAAGCTICTATATC TACAAGTA3 原变异株 ，并对其 VP2基 因进行 了克隆和序列分 其中上游引物 5端含 RamHI酶切位点，下游引物 析 ，为了解 CPV变异及制备 CPV特异诊断试剂奠定 3端含 Hindill酶切位点。 了坚实基础 。 PCR反应体系 ：10×ExTaqbuffer5 “L，dNTP (2．5mmol／L)4tLL，引物 VP2F和 VP