猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用.pdfVIP

维普资讯 中国兽医学报 2008年4月 第28卷 第4期 Ch／nJVetSciApr．2008Vo1．28 No．4 451 猪 Y．干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用 姚清侠，黄勤锋，曹 毅，司有辉，钱 平，陈焕春 (华中农业大学兽医学院，湖北武汉430070) 摘要：为了获得高效分泌表达重组猪 干扰素 (rPolFN7)，将去除信号肽的编码梅 山猪 干扰素成熟蛋白基 因 (mPolFN7)插入酵母一大肠杆菌穿梭载体DPIc9K中，构建成分泌型重组表达载体 pPIC9K-mPolFN7。将线性化的 pPIC9K-mPolFN7以化学方法(Ijc1)转化入毕赤酵母菌株GS115(组氨酸缺陷型)，转化子经MD平板筛选和PCR分析 鉴定后，以G418(4g／L)筛选到多拷贝菌株。SDS和Western-blot检测结果表明，所获得的重组子能够分泌表 达出17000和23000左右的mPolFN7特异蛋白，其表达量约为 120mg／L，占分泌型总蛋白的65％；细胞病变抑制法 (CPE50)测定干扰素生物活性，结果表明rPolIFN7具有较高的抗病毒生物活性，在MDBK中的抗VsV比活性为 1．67 ×lO6U／mg。 关键词：猪 干扰素；毕赤酵母；分泌表达；抗病毒活性 中图分类号：$828；$5824 文献标识码 ：A 文章编号 ：1005—4545(2008)04—0451—05 Secretingexpressionofporcineinterferon·gammain P／cha／pastorisandits antiviralactivity YAOQing-xia，HUANGQin—feng，CAOYi，SIYou—hui，QIANPing，CHENHuan—chun (CollegeofVeterinary Medicine，HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan430070，China) Abstract：Tohighlyexpresssecretedporcineinterferon-gamma(rPolFN7)，山esignalpeptidewasexcisedfromtheinterferon- gammageneandhtematuregene(mPolFN7)wasclonedintotheyeast—EscherichiashuttlevectorpPIC9Ktoconstructescreting recombinantexpressingplasmidofpPIC9K-mPolFN7，rI1l1epPIC9K—mPolFN7WaslinearizednadtransformedintoPichiapastoris cellsGS115withLiC1．TheGS115WasdefectivewithhistidiBe(His)．rI1l1etransformantswereeslectedwihtMDcultureplatenadi- dentifiedbyPCRAndhten，htemultieopyrecomb innatP／ch／apastor／sstrainWasselcetedbyG418(4g／L)resistnace．rI1l1eselect— edsrtaincouldspecificallyescret170oonad230oomPbIFM proteinswhichWas demonsrtatedbySDSnadWestern．blot． ThePolFN7proteinsamounttoabout65％ oftotalsecretedproteinswiht hteconcentrationof120mg／L．Thenativiralactivityof rPolFN7Was testedbyCPES0mehtod．rI1l1eresultsshowde htattherPolFN7hadhighnativiralactivity．whichWas