猪生殖与呼吸综合征病毒的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR检测.pdfVIP

维普资讯 中国兽医科学 2008，38(05)：401—406 ChineseVeterinaryScience 中图分类号：S852．659．6：Q503 文献标识码 ：A 文章编号：1673—4696(2008)05—0401—06 猪生殖与呼吸综合征病毒的SYBRGreen-I 荧光定量 PCR检测 王小武 ，符 芳 ，许红喜 ，周艳君 ，童光志 ，李 曦 (1．中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 ，黑龙江 哈尔滨 150001； 2．黑龙江八一农垦大学 ，黑龙江 大庆 163319) 摘要：根据猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)GP5蛋 白基 因核酸序列设计 引物 ，经 BLAST 比较发 现 ，该 引物 既可以扩增较早发现 的 PRRSV毒株，也可以扩增近期发现的在 Nsp2基 因上有较大变异 的 PRRSV毒株，以含有该引物扩增序列的重组质粒作为标准品建立 了检测PRRSV 的SYBRGreen-I荧光定 量PCR方法。结果表明，该方法标准曲线的相关系数大于0．99，敏感性可以达到 1×10拷贝／L，约为普通 PCR的 i00倍 ；用该方法检测人工感染PRRSV 的猪全血，结果阳性检 出率为 i00 。敏感性 、特异性和稳 定性试验表明，该方法具有很高的敏感性、特异性和稳定性，可以用来快速检测 PRRSV。 关键词 ：猪生殖与呼吸综合征病毒 ；SYBRGreen-I；荧光定量PCR EstablishmentofSYBR Green- real--timefluorescentquantitativePCR fordetection ofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus WANG Xiao—wu ，FU Fang，XU Hong-xi，ZHoU Yan-jun，TONGGuang-zhi，LIXi (1．HarbinVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Harbin150001，China； 2．HeilongJiangEight—FirstLandReclamationUniversity，Daqing163319，China) Abstract：A pairofprimersweredesignedbasedon thesequencesofPRRSV GP5proteingene．The ampliconwas502bp，whichwasusedtodevelopSYBR Green-IfluorescentquantitativePCRfordetecting PRRSV．Theresultsshowedthatrvaluesexceeded0．99in thestandardcurveofthedevelopedPCR met— hod．Thedetection1imitofthePCRwas10copies／￡lL，whichwasi00foldsensitivethanthatofthecon- ventionalPCR．The54serafrom thepigsinfected-experimentallywithPRRSV wereexaminedbythePCR， and thepositivedetectionratewasi00 ．ThisPCR assaywassensitive，specificandstableforrapiddetec— tionofPRRSV ，withapositivedetection rateofi00 ． Keywords：porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)；SYBR Green-I；real—time quantitativePCR 猪生殖与呼吸综合征病毒 (porcinereproduc— 状和高死亡率为特征[2。]。1991年，荷兰科学家 tiveandrespiratorysyndromevirus，