牦牛乳酸脱氢酶A的分离纯化、酶学性质及其基因的克隆.pdfVIP

维普资讯 中国农业科学 2008，41(5)：1470—1475 ScientiaAgriculturaSinica 牦牛乳酸脱氢酶A的分离纯化、酶学性质及其基因的克隆 郑玉才，司晓辉，贺庆华，金素钰，洪 键 (西南民族大学生命科学与技术学院，成都 610041) 摘要：【目的】分离纯化牦牛骨骼肌中的乳酸脱氢酶一A(LDH-A)，并克隆其 cDNA。通过比较牦牛与普通牛的 LDH—A的酶学性质和 eDNA序列，为研究牦牛适应高海拔、低氧环境，在分子水平上找到一些线索。【方法】采用 染料亲和层析和 DEAE-Sephadex离子交换层析等方法，分别从牦牛和普通牛骨骼肌中纯化 LDH—A，并对其酶学性 质进行比较；通过RT-PCR方法克隆牦牛LDH—m的cDNA序列，并与GenBank登录的普通牛LDH—A的cDNA序列进行 比对。【结果】纯化的牦牛LDH—A比活力为 103．9u．mg’蛋白，纯化倍数为 18．2。SDS—PAGE和PAGE分析均显示一 条带。酶动力学参数测定显示，牦牛LDH-A的 NADH为 0．097， 丙酮酸钠为 1．897，均不同程度高于普通牛， 其中对丙酮酸钠的 大约是普通牛的2倍。根据牦牛LDH-A的cDNA序列预测的氨基酸序列与普通牛LDH—A的氨基 酸序列比较，只有2个氨基酸残基的改变 (257Va1-Ala和315Tyr-Cys)。【结论】牦牛LDH-A对丙酮酸的高 可避 免骨骼肌中产生过多的乳酸，是适应进化的结果；这种升高可能与其氨基酸序列变化导致的空问结构微小改变有 关 关键词：牦牛；乳酸脱氢酶；纯化；动力学性质；基因克隆 PurificationandPropertyofYakLactateDehydrOgenase-A andSequenceofItscDNA ZHENGYu—cai，SIXiao—hui，HEQing—hua，JINSu—yu，HONGJian (CollegeofLfieScienceandTechnology；SouthwestUniversi~forNationalities，Chengdu610041) Abstract：[Objective]Inordertoinvestigatethemolecularmechanismoftheabilityofyak(Bos．grunniens)toadapttohigh altitudeandlowoxygenenvironment，htelactatedehydrogenaseA(LDH—A)fromyakskeletalmusclewaspurifiedandcharacterized， naditscDNA wasamplified，clonedandsequenced．Thekineticsoftheyka LDH—A anditscDNA sequencewerecomparedwith htoseofbovineLDH—A．[Method]DyeaffinitychromatographyandDEAE—Sephadexion—exchangechromatographywereusedto purifyhteLDH—Arfom skeletalmuscleofboht yka andbovine．Thepropertiesoftheseenzymeswereanalyzedbykineticanalysis andcomparedbetweenthetwospecies．ThecDNA ofyakLDH—Awasclonedbyreversetranscriptase(RT)一PCRmehtodand compraedwiththesequenceofthebovineLDH—AcDNAintheGenBank．[Result]Theyka LDH—Awasenrichedby18．2foldand itsrelativeactivitywas103．9U-mg—protein．OnlyonebandwasobservedwhenhtepurifiedLDH—AwasseparatedonSDS—PAGE ornon—denaturedPAGEge1