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东方巴贝斯虫EST序列分析及其线粒体基因的测定 摘 要 东方巴贝斯虫(Babesiaorientalis)是一种经镰形扇头蜱传播的重要血液原 虫，是由本实验室发现并命名的一个巴贝斯虫新种，主要引起水牛巴贝斯虫病。 该病在我国长江以南许多省份发生和流行，临床上患病牛以高热、贫血、黄疸和 血红蛋白尿等为特征，甚至引起死亡，造成重大的经济损失。 orientalis 本研究首先利用本实验室构建的Babesia eDNA文库，进行了 B．orientalis EST序列的测定和分析，并对所得的EST序列结果进行电子克隆延 伸，针对EST的分析结果和延伸结果，选取线粒体基因进行克隆和测序，并进 一步构建了细胞色素b基因的系统发育树。 (1)B．orientalis EST序列的测定和分析 从B．orientaliseDNA文库中随机挑取噬菌斑，转染Bm25．8，经PCR鉴定 后将插入片段大于300 EST bp的阳性克隆子测序，共测定了1514条B．orientalis 序列，对有效EST序列运用phrap等软件进行拼接，聚类后BLAST分析，得到 1171个同源性较高的unigene，这些基因分别为：线粒体基因、RNA结合蛋白、 类红细胞表面抗原、类裂殖体表面抗原、代谢相关的磷酸酶及蛋白酶、衰老相关 蛋白、核糖体蛋白、热休克蛋白70、类热休克蛋白90、肌动蛋白、锌指蛋白、 protein)基因部分或全基因；并且推测出共计5条可能的代谢途径，包括氧化磷 酸化代谢途径、核糖体途径、细胞因子受体途径、细胞凋亡途径、抗体加工及呈 递途径等多种代谢途径。 (2)B．orientalis EST序列的电子克隆延伸和分析 对所得的1514条EST序列逐条进行电子克隆延伸，其延伸长度由原来EST 序列平均长度的593．7 bp延长至819 bp，延长了约1．4倍。83条可能的新基因中， 与原虫具有同源性的基因数有15条，另外有69条EST序列与原虫有关，对其 中5l条进行了完全电子克隆的延伸。 (3)B．orientalis线粒体基因的克隆、测序和生物信息学分析 根据获得的EST序列分析结果和电子克隆分析结果，选取了转录丰度非常 高的线粒体基因作进一步研究，其编号为Conti918，设计特异引物对这条候选序 列各基因进行克隆和测序，只有少部分由于线粒体的自身特点无法测序得到，从 东方巴贝斯虫EST序列分析及其线粒体基因的测定 而证实了电子克隆的有效性。同时还对线粒体上的各个基因做了分析，并对细胞 色素b基因进行了系统发育分析，并结合原虫的18S系统发育树结果，对本实验 室所发现的Babesiaorientalis进行更精确的系统发育定位。 本研究对东方巴贝斯虫EST序列的测序、电子克隆与分析，以及线粒体基 因的测定，不仅加深了我们对东方巴贝斯虫分子水平上的理解，并且对进一步研 究东方巴贝斯虫各个功能基因提供了基础和依据，为后期进一步研究东方巴贝斯 虫线粒体各基因创造了条件。 关键词：东方巴贝斯虫；EST分析；电子克隆；线粒体；细胞色素b基因 2 东方巴贝斯虫EST序列分析及其线粒体基因的测定 Abstract Babesiaorientalisisallintraerythrocyticprotozoanofthebuffalo parasite Bubalusbubal括transmittedthetick haemaphysaloides by Rhi