乳鼠及犬脑组织狂犬病病毒的分布定位研究.pdf

乳鼠及犬脑组织中狂犬病病毒的分布定位研究 摘要 选取6日龄雄性昆明鼠，人工脑内接种狂犬病病毒SRV-9毒株，当其出现神经症状后， 生物安全条件下，无菌采集脑组织，另外还有自然感染犬的脑组织，将每个脑组织一部分 用4％多聚甲醛固定，另一部分应用套式RT-PCR及直接免疫荧光抗体试验进行检测。 和RHN3，建立狂犬病毒的套式RT-PCR检测方法，此方法可以特异地检测出狂犬病病毒 工脑内接种狂犬病病毒SRV-9毒株的乳鼠及自然感染犬的脑组织样品，凝胶电泳观察均可 以观察到特异的344bp的条带。此外，应用异硫氰酸荧光素标记的抗狂犬病病毒单克隆抗 体进行直接免疫荧光抗体试验，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光，即为狂犬病病毒抗原。 建立间接免疫组织化学方法进行狂犬病病毒脑组织中的分布定位研究，优化免疫组织 化学方法中的各种条件，通过辛酸一饱和硫酸铵沉淀法、DEAE52纤维素离子交换和蛋白A 层析相结合的方法，制备纯化抗体，得到浓度为2．216mg／ml的马抗狂犬病病毒抗体及浓 PH6．0柠檬酸缓冲液为抗原修复液， 检测抗体效价为1：3200。通过反复试验确定以o．01M 高温高压及胰蛋白酶消化法相结合的抗原修复方法，一抗及二抗的最佳工作浓度分别为l ：50与l：100等为最佳条件，建立了敏感性高、稳定性强、可重复性高的免疫组织化学 方法。 应用建立的间接免疫组织化学方法，与组织病理学HE染色相比较，对上述10只人工 感染狂犬病病毒的乳鼠及8只自然感染犬的脑组织中狂犬病病毒分布定位进行研究，得到 了较好的效果，组织病理学HE染色乳鼠脑均未观察到病毒嗜酸性包涵体，在4只犬脑在 小脑蒲肯野氏细胞胞浆中发现包涵体。而间接免疫组织化学方法染色均为阳性，其检出的 阳性率与套式RT-PCR及直接免疫荧光抗体试验相符。脑组织中的病毒抗原在乳鼠及犬的 大脑皮质的锥体细胞及小脑蒲肯野氏神经元等细胞胞浆中均呈强阳性；在乳鼠脑海马角 CAl、CA3区神经元(包括齿状回)呈弱阳性分布，而在犬脑此区呈强阳性。 本研究为狂犬病的发病机理、病毒抗原在感染动物机体内分布情况等基础性研究奠定 了一定的基础。 学，病毒嗜酸性包涵体 The of thedistributionandlocation study ofrabiesvirusin miceand suckling caninesbrainstissues Abstract The6 oldmicewere infected withSRV-9rabies days artificially virusstrainvia intracerebralinoculation．When clinicalwere mousewere signs presented，all killed humanely inthe andsterilesituation．Someofthebrain tissuesfromthemiceand biologicalsafety natural infectedcaninesbrainswerefixed inthe for theothers