天然四倍体泥鳅色体组操作及微卫星分析.pdfVIP

Chromosome manipuIations in the polyploid of loach and Microsatellite analysis By Qi Hongrui A Master’s Degree of Animal Genetic Breeding and Reproduction Supervisor: Professor Li Ya Juan 2 该研究由：国家自然科学基金项目）、 辽宁省科学技术基金项目（201102019 ）和大连海 洋大学博士启动基金项目（017208 ）资助 摘要 摘 要 鱼类染色体组操作主要包括多倍体的人工诱导、雌核发育和雄核发育等，在鱼类遗传 育种中占有重要的地位。本文为探讨鱼类人工诱导四倍体及雄核发育二倍体的新方法，以 天然四倍泥鳅、二倍体泥鳅为研究对象，通过冷休克处理抑制第二极体释放，诱导四倍体， 对其所产生后代的染色体数目、DNA相对含量、血红细胞核体积及微卫星等进行了较系统 的分析；并采用冷休克方法诱导四倍体泥鳅雄核发育二倍体，对其后代的胚胎发育、倍性 鉴定及用微卫星标记对雄核发育个体进行分析鉴定。具体结果如下： （1）冷休克诱导泥鳅四倍体的研究：结果表明，血红细胞核体积测定四倍体泥鳅的 红细胞核长轴、短轴以及体积都显著大于三倍体 （P0.01 ）。流式细胞仪共检测一龄鱼147 尾，其中三倍体泥鳅共31 尾，四倍体泥鳅共116 尾，占总数的78.9% ；对流式细胞仪已确 定的三倍体和四倍体泥鳅各3 尾的鳍细胞体外培养进行染色体计数。结果显示，三倍体泥 鳅染色体数目为3n = 75，四倍体泥鳅染色体数目为4n ＝100；三种倍性鉴定方法结果一致。 本试验采用了15 对引物，筛选4 对引物 （Mac24 、Mac37、Mac63 、Mac425 ）用于微 卫星标记的分析。结果表明，对照组均遗传父母本的特异性条带，测得四倍体个体的基因 型，均为杂合子。本实验通过倍性分析和分子标记的结果分析，证实了2n x 4n 通过冷休 克抑制第二极体释放成功诱导四倍体。 （2 ）冷休克诱导天然四倍体泥鳅雄核发育二倍体：结果表明，实验组中受精率与孵 化率均略低于对照，但差异不显著(P 0.05) ；7 天成活率中雄核发育实验组仅有极少数的 成活仔鱼 （8.30% ）与对照组(40.57%)差异极显著(P 0.01) 。分别实验组和对照组选取20 个胚胎，对照组主要分布于 71-76 之间,其众数在 3n = 75 ；而实验组中染色体数量分布于 46-80之间 ,染色体数目为 3n = 75 的有4个,染色体数目为 2n = 50 的有16个为二倍体，诱 导率较高。 本试验采用了 5 对微卫星引物中，筛选获得 2 对引物 （Mac45 、Mac60 ）其亲本基因 型完全不同，可用于进行雄核发育后代的鉴定。在引物Mac45 中可确定母本基因型为106/86, 父本的基因为51/53，雄核发育后代中基因型为51/51 和51/53，达到26.0% 。同样在引物 Mac60 的微卫星标记中雄核发育后代的遗传父本基因型 107/120，而不遗传母本基因，表 明雄核发育后代染色体组减半，只遗传物质来自于父本而非母本。 研究结果表明，无须卵子失活，仅用冷休克成功诱导了天然四倍体泥鳅雄核发育二倍 体及冷休克抑制第二极体释放诱导成功四倍体，该研究结果进一步证实了天然四倍体泥鳅 是具有4套染色体组的遗传的四倍体，能产生二倍体（2n ）配子，是进行多倍体育种的良 好材料，而且为全雄鱼生产及多倍体育种提供了新的途径。 关键字：天然四倍体；人工诱导四倍体；冷休克；雄核发育；微卫星 I