家蚕来源肠球菌rapd分型及类肠球菌素的分离纯化.pdf

中文摘要 肠球菌是家蚕消化道中的一种正常菌群。它直接参与了宿主的多种生理 代谢活动，是宿主正常生理活动不可缺少的重要组成部分。 同时肠球菌也是一种潜在性致病菌，健康家蚕对其具有足够的预防能 力，只有在宿主体质虚弱或环境不良的情况下才会发挥致病作用，是引起家 蚕细菌性肠道病的病原细菌，因此探讨该菌丛的生物学特性及生态变化，对 了解家蚕细菌性肠道病致病机理和肠球菌与其它病原微生物互作等方面都 具有重要意义。 传统的数值分类学的鉴定方法，工{乍量大、时间长。随机扩增DNA多 态性分析(RAPD)技术是分子生物学中重要的研究手段之一。它能在DNA 水平反映不同样本之间的差别。本试验通过优化M{广浓度、DNA模板加入 DNA聚合酶加入量、PCR反应循环次数等建立了家蚕来 量、引物浓度、Taq 源肠球菌的RAPD-PCR反应体系，并对从家蚕消化道中分离的表现为生理 生化特性多样性的14个肠球菌分离菌株和3个标准菌株进行了DNA多态性 研究。确定了家蚕来源肠球菌RAPD分析的反应体系：扩增反应总体积25 200 mmol／L；dNTPsmmol／L； 皿，，反应液中含模板DNA为50ng；M矿3．5 U；引物浓度15 DNA聚合酶3 raq pmol／L；PCR扩增程序为：94℃预变|生 3rain，94℃变性40S，35℃退火408，72℃延伸lrain，45次循环，最后～ 个循环72℃延伸10rain，然后4℃保存。应用筛选的8条随机引物，共扩 增出625个位点，其中99．7％为多态性位点，表明供试菌株具有丰富的DNA 多态性。对扩增结果进行聚类分析，供试菌株分为Entfaeciwn、 4个类群。本试验RAPD分型结果 Ent．casseliflavus、Ent．avium、Entfaecaiis 与前期数值鉴定结果基本一致。 本研究室前期研究结果表明，家蚕来源肠球菌外分泌蛋白具有抑制N．b Z3U)和家蚕微孢子虫 发芽的作用。本试验以家蚕来源肠球菌(Entfaecatis (Nosema 分泌蛋白含量高的培养基，并对抑制微孢子虫发芽的菌外分泌蛋白进行了初 步的分离纯化，以期为利用肠球菌开展蚕病的微生态防治挹洪参考。 培养基的筛选试验表明，进口MRS(．G)培养基所得透析液的底色较 浅，对用分光光度法测定微孢子虫的发芽抑制率影响最小。吐温添加量控制 V 在5．109／L，在37℃150r／rain条件下培养30h时EfZIU的生长情况最好， 细菌繁殖达到最高峰，以后随着培养时间的延长，培养基中养分逐渐消耗， 细菌处在对数生长曲线后期，细菌数目逐渐减少。用Bradford法测得其蛋白 含量最大可达3．32 mg／mL，对家蚕微孢子的发芽抑制率在72．0％。 G-75柱，收 蛋白分离纯化试验结果表明，将蛋白粗提液过Sephadex 集其3个吸收峰，用PEG包埋法浓缩后进行微孢子虫发芽抑制试验。结果 峰I、Ⅱ对微孢子的发芽相对抑制率在20．5％，峰Ⅲ的相对抑制率在59．0 ％，说明活性物质主要存在于峰IⅡ中。 SDS．PAGE电泳结果表明峰I、II没有蛋白条带，峰ⅡI有三条主要的 蛋白带，分子量在50～80kD之间。说明主要的活性物质是分子量在50～ 80kD之间的一种或多种物质，其可能是多肽类物质，也可能是细菌毒素类 物质。 添食试验结果表明，E．f．ZJO外分泌蛋白在家蚕体内能抑制N．b发芽， 从而降低微孢子虫病的发生。 关键词： 随机扩增DNA多态性分析(RAPD)；肠球菌；外分泌蛋白；家 蚕微孢子虫；发芽抑制率 ABSTRACT wasthe