家蚕谷胱甘肽s转移酶(gsts)的组织分布、变化规律及酶学性质研究.pdfVIP

摘 要 谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是生物体内一类催化还原型谷 胱甘肽(glutathione,GSH) 与各种亲电子化合物结合的代谢酶。这类酶广泛存在于动 物、植物、昆虫、酵母、霉菌和各种细菌中,是一类在内、外源化合物的生物转化、药 物代谢及保护生物体免受过氧化作用损害极为重要的多功能蛋白质。该酶能使有害的 亲电子物质与体内还原型谷胱甘肽(GSH)结合形成可溶性的物质，从肾脏或皮肤中排 出，从而起到排毒的功效；同时该酶参与转运体内重要的脂类化合物，为谷胱甘肽的 硫原子提供电子的亲核反应。因此关于GSTs 的研究一直受到关注。随着科技与医学的 不断发展，人们发现GSTs可解除化学诱变剂、促癌剂、脂质及过氧化物等内、外源性 化合物的毒性，保护正常细胞免受致癌物和促癌因素的影响，在抗诱变和抗肿瘤中起 到重要作用；另外，GSTs 的同工酶还含有谷胱甘肽过氧化物酶的活性，能清除脂类自 由基，在抗脂质过氧化反应中起着重要作用。在植物中，GSTs也有类似的功能，可作 为植物化学物质的结合与转运蛋白，也可催化体内GSH与各种内、外源性化合物结合： 如可催化GSH与异源性物质如除草剂的结合反应而达到解除异源物质对植物体的毒害 作用。在昆虫中，GSTs是一类与昆虫抗性相关的代谢酶。 家蚕是一种重要的经济昆虫，一直被作为生产生丝及遗传研究的模式生物；同时， 又是通过原核表达系统生产重组蛋白的生物反应器。世界上约70％的农业害虫属于鳞 翅目昆虫，通过对鳞翅目昆虫的模式生物——家蚕的研究获得解毒方面的数据也可运 用到农业害虫上。尽管家蚕在经济上有重要的应用价值，但关于家蚕GSTs 的性质、功 能等方面的研究却鲜有报道。本文研究了家蚕体内GSTs 的组织分布、发育期变化规律； 对家蚕GSTs进行了分离纯化，并对纯化后家蚕GSTs 的性质与功能进行了研究与探讨。 以同一世代的卵、幼虫、蛹、成虫为试验材料，研究了家蚕体内GSTs 的组织分 布、发育期的变化规律。在蚕的一个世代发育过程中，催青前蚕卵 GSTs 活性很低， 后快速升高，至孵化为蚁蚕时达到最大值；以后逐渐降低，5 龄起蚕后又渐渐上升， 化蛹第1 天和第11 天各出现一个峰值，其余蛹期和成虫期维持在与3 龄、4 龄起蚕大 致相当的活性水平，波动不大。在5 龄家蚕的不同组织部位中，脂肪体和中肠中的活 性相对较高，表皮和头部GSTs 的活性相对较低； 5 龄家蚕的同一组织中GSTs 活性 变化存在一个变化趋势：从饷食至盛食期，活性均逐渐升高，到5 龄第3 天达到最高 峰，随后呈下降的趋势。品种间GSTs 活性：夏秋用品种体内GSTs 活性高于春用种， 杂交种体内GSTs 活性高于原种。 为了解家蚕 GSTs 的性质、结构、功能等方面的相关内容，我们以苏镇×春光的 I F1 代杂交种的幼虫为试验材料，运用亲合层析方法，纯化得到一种家蚕GSTs ，并对 该酶的酶学性质、稳定性做了一些研究，同时也作了一些体外抑制的探索工作。纯化 后的家蚕GSTs ，其比活力为4.61µmol•min-1•mg-1 ；从SDS电泳图上，可看出 纯化后的 GSTs 仅有一条带，分子量约 28kDa ；利用双倒数图，分别得出以 GSH 和 CDNB 为底物时的Km 和Vm 值；同时，根据家蚕GSTs 的分子量，分别得出了在以 GSH 和CDNB 为底物时的酶的转化数（Kcat ）及酶的催化效率（Kcat/Km ）；在研究 GSTs 的稳定性时，发现pH 在7.1 时家蚕GSTs 的酶活性最大；在一定的温度范围内， 酶活性随着温度的升高而增大，但当温度升至25 ℃后，酶活性就逐渐降低；在以阿苯 达唑、吡喹酮、氯化钠及胆汁酸为抑制剂的探索性实验中，结果表明：这些抑制剂对 家蚕GSTs 的抑制效果都比较弱。 关键词：家蚕，谷胱甘肽S-转移酶，组织分布，发育期变化规律，分离纯化，性质 II Abstract Glutathione S-transferases (GSTs, EC 8) are metabolic enzymes