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家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 中文摘要 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 中文摘要 溶茧酶是蚕蛾在羽化的过程中分泌的一种蛋白水解酶，用于水解、软化茧的 先端，以便于珊化后的蚕蛾脱茧而出。研究家蚕蛾溶茧酶，不仅对蚕蛾脱茧而出 这一生理过程的认识具有重要的理论意义，而且对蚕丝蛋白的进一步开发利用也 将产生积极的影响。 从刚羽化的家蚕蛾的头部提取总RNA，利用cDNA末端快速扩增技术(rapid ofcDNA 黝pliflcationEnds，RACE)克隆了家蚕溶茧酶5’端和3’端序列，获得了家 有l047 bp，包括54bp的5端非编码区(5UTR)、780bp的蛋白质编码区、终止 密码子TAA和210 bp的3’端非编码区(3UTR)。该序列可编码260个氨基酸的蛋白 质，预测蛋白质分子量为27．6 kD，等电点(pI)为8．886。与家蚕基因组比对后发 现该基因包含4个内含子和5个外显子，外显子／内含子边界符合经典的GT．AG规则。 3．0Sen，er程序分析家蚕蛾溶茧酶基因，预测其从第1．22位为信号肽序 用Si鄹出P 列。SMART分析结果预测其第34．254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶 活性，并且利用生物软件DNAS吖岖分析了家蚕蛾溶茧酶基因cDlNA序列的调控元 件，这些可为今后对溶茧酶基因的进一步研究提供参考。 SDS．PAGE分析结果表明，家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达，相对分子量为 48kD。本研究还进一步构建了该基因的真核表达载体，在Bac．to．Bac系统中进行 表达，表达的27．6 kD蛋白，与推导的融合蛋白大小相符。该表达产物与茧丝反应 后，在电镜下观察茧丝的形态，结果表明，表达产物对茧丝的丝胶层有一定的水 解作用。 为了利用家蚕溶茧酶基因的启动子构建能够表达外源基因的生物工厂，通过 l 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 中文摘要 PCR扩增获得该基因的启动子序列并进行克隆和序列分析。进一步构建了由 贪夜蛾Sf9细胞中进行了表达。结果显示：COCoonaSe基因的启动子序列符合真核生 物启动子的特点，并具有复杂的茎环结构，这可能与蛋白表达的时空特异性有关。 病毒转染试验表明：Coc00naSe基因启动子可以驱动绿色荧光蛋白基因GFP在培养 的Sf9细胞中表达。 关键词：家蚕；溶茧酶基因；cDNA片段末端扩增；序列分析；原核表达；真 核表达；杆状病毒系统；BaC-to．BaC系统；启动子 作 者：吴玉丹 指导教师：沈卫德 Ⅱ and Otofthetne乙OCOOnaSeCocoonaseUeneGene矗omtrOm ClOmnganCL上，XpreSSlOn CloningExpression ofits 召D聊协聊D力andactiVityanalysis promoter ABSTRACT Cocoon硒eisa secretedsilkmom usedfor by eclosion，aIld prote嬲e during“s mecocoonendinconVeIlie