猪圆环病毒的分鉴定及检测方法的建立.pdfVIP

摘 要 猪圆环病毒（PCV ）是近年受到广泛关注的危害世界养猪业的重要病源之一。PCV 具有 PCV1 和PCV2 两种基因型。根据致病性、抗原性、核苷酸序列，将从PK15 细胞系分离的圆环 病毒列为圆环病毒 1 型（PCVl ），把与断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS ）等密切相关的圆 环病毒列为2 型（PCV2 ）。本研究主要是从河北保定地区某猪场疑似PMWS 的发病猪病料中分 离到一株病毒，经PCR 鉴定、生物学特性的鉴定，进而建立快速准确的临床诊断方法。 无菌采集疑似PMWS 的病猪病料，将其腹股沟淋巴结接种PK-15 细胞。由于猪圆环病毒 在 PK-15 细胞上不产生细胞病变，接种 72h 后收毒，盲传至四代。根据 GenBank 上已发表的 PCV2 基因序列，设计并合成了一对扩增ORF2 基因序列的特异性引物，对细胞毒提取DNA ， 经PCR 扩增，得到485bp 特异性的核酸片段。 本研究采用过氧化物酶单层实验（IPMA ）测定PCV2 分离毒的TCID50 ，并基于此方法对 理化特性进行研究。实验结果表明：该毒株病毒液在PH3 和PH12 作用 1h 后TCID50 均没有显 著变化，毒株表现出较强的耐酸碱性；对胰蛋白酶不敏感；经乙醚、氯仿处理后TCID50 的差值 均小于2 ，说明该病毒没有囊膜。试验结果均符合PCV2 生物学特性。 根据 Genbank 上已发表的猪细小病毒（PPV ）和猪伪狂犬病毒（PRV ）的基因序列，应用 Primer Premier 5.0 软件进行分析，设计并合成扩增PPV VP2 基因片段和PRV UL39 基因片段的 特异性引物，并建立多重 PCR 的方法，在同一个反应体系中可同时扩增PCV2 、PPV 和 PRV 的特异性片段。通过对引物用量、反应温度、模板用量等反应条件的优化，达到较为理想的扩 增效果，并且特异性和重复性良好。之后对PCV2 的PCR 产物用Xba I 单酶切，获得了267bp 和228bp 的两个片段，并构建质粒pMD18T-PPV 和pMD18T-PPV ，分别用BamHI 和HindIII 双酶切，获得PPV 158 bp 和PRV 219 bp 的目的片段，之后通过序列测序，分别证实了扩增的 条带的准确性。 本研究建立了用于检测PCV2 的双向乳胶凝集实验的诊断方法，通过对乳胶最佳致敏浓度、 最佳致敏温度和最佳致敏时间的测定，确定致敏乳胶的最佳条件，并对致敏乳胶的稳定性进行 检验，包括保存的温度和保存时间的检查。乳胶凝集抗原质量的鉴定包括用PBS 、BBS 、生理 盐水进行的自凝性检测和用 PRV 阳性血清、猪瘟阳性血清、PCV 阴性血清和犊牛血清进行的 特异性检测。结果表明，本研究所建立的PCV2 双向乳胶凝集实验准确快速、简便特异，适用 于基层单位用于血清学诊断。 关键词：猪圆环病毒；理化特性；多重PCR ；双向乳胶凝集实验 Isolation and Identification of Porcine Circovirus and Establishment of Detection Methods Author:Han Xinying Supervisor:Professor Yang Runde Specialty:Preventive Veterinary Medicine Abstract Porcine circovirus （PCV ）is one of infectious disease sources in the world which was widesread focus on.There are two genotypes,PCV1 and PCV2. According to pathogenicity,antigenicity and nucleotide sequence,t