猪表皮干细胞体分离、培养和建系研究.pdfVIP

摘 要 皮肤的表皮终生处于增殖、分化和脱落的不断更新之中，这正是由于其中表皮干细胞 Stem (EpidermalCells。EsCs)不断增殖分化所致．表皮干细胞是一种在体内具有无限更新能力， 且能分化形成全层表皮的细胞，在体外培养具有长期生长潜能．开展分离纯化表皮干细胞建系研 究，为表皮干细胞应用于医学临床的组织工程和人类重大疾病的细胞治疗打下技术基础．本研究 ZhiShah 以五指山实验用小型猪(Yu Pigs，wzSP)近交系的耳组织为材料，分别从不同日龄猪、 不同胶原、条件培养基和表皮生长因子等方面对ESCs分离培养的影响进行了研究，旨在探索Escs 的最佳分离培养条件，并在该条件下建立三个表皮干细胞系，对所培养的EsCs进行了染色及免疫 组化鉴定。得出研究结果如下： 1．不同因素对猪表皮干细胞分离培养的影响研究 采集4日龄、1月龄、3月龄、12月龄猪耳组织分离表皮干细胞，分别计算各组细胞的贴率。 结果表明，随着实验猪日龄的增长，表皮干细胞的贴壁率逐渐降低，其中4日龄组贴壁率为12．68 离纯化表皮干细胞的材料． 将分离得到的表皮细胞分为两组，～组接种于I型胶原包被的六孔扳中，另一组接种与Ⅳ型胶 原包被的六孔板中。15rain后洗去未贴壁细胞，计算两组细胞的贴壁率。结果表明，I型胶原组 选表皮干细胞的基质。 将分离纯化出的表皮干细胞分为两组，一组采用条件培养基培养，另一组采用DMEM／F12(1： 1)+15％血清培养．结果表明，条件培养基培养组细胞生长状况良好，呈克隆状生长，且传几代 之后也不易发生分化，而有血清培养基培养组细胞生长速度非常缓慢，且从第二天开始就出现了 分化现象，以后分化细胞逐渐增多，不能够形成克隆状。因此，在没有饲养层的条件下，表皮干 细胞的培养必须添加条件培养基。 液细胞增殖速度显著低于其他各组(PO．05)。 2．猪表皮干细胞的建系研究 消化制成单个表皮细胞悬液，接种在Ⅳ型胶原包被的培养瓶内，采用条件培养基(m咧／F12(1： IGF-I+o．5ll 1)+1傩条件培养液+5IXg／mLinsulin+20ng／mLEGF+20ng／mL gig氢化可的松)培 养，0．25％胰酶消化传代．表皮干细胞能够快速黏附在Ⅳ型胶原上，呈克隆状生长，一般传代间隔 为7天左右．已建立三个表皮干细胞系，均已传至20代以上． 3．猪表皮于细胞的鉴定及分化研究 取生长良好的第lO代表皮干细胞进行AKP染色鉴定。结果呈阳性．K19和p1整合素免疫组 化染色亦均呈阳性。证明所分离得到的细胞为表皮干细胞．将消化传代EScs接种在铺明胶的培养 瓶中培养3周左右，可逐渐分化成表皮膜片。 关键词 表皮干细胞，细胞培养，鉴定 Abstract tistflle ismaintaineddivisionofcoilsinthe basal to integrity layer Epidermal by proliferative diffegntiatedcellsintheoutmoststratumthat lost．This of∞玎 replace layerarc：continuallyhierarchy enddifferentiationismaintainedasmall ofsteincoilscalled proliferation by subpopulation epidmnal arc ESCsretaina ofself-renewal adultlifoand