绵羊myosttin基因shrna慢病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

中文摘要 本研究的目的是构建绵羊myostatin基因 RNA干扰 (RNAi) 慢病毒载体，并 评估其对myostatin基因表达的沉默效果。方法是，在Genebank 中检索目的基因的 序列，获得sheep 的myostatin 的序列，根据ambion 的shRNA设计系统，设计、合 成4对针对myostatin基因shRNA 干扰载体。合成全基因序列，将合成好的全基因 序列装入pMD-18T载体并转化至感受态细胞DH5α，测序验证发现有突变点，通 过重叠PCR将基因序列中突变点修复，将突变后的全长片段用XhoI和EcoRI酶切 后连接至目的载体pCDNA3.1(+) ，并转化到感受态细胞DH5α中，经测序验证， 重组克隆中插入片段序列与目的基因序列完全一致，高效表达载体构建成功。用 Lipofeetamine2000将pcDNA3.1-Ovis aries MSTN质粒、shRNA 干扰载体共转染至 HEK293细胞，48h后取一部分细胞做qPCR ，通过qPCR检测细胞样品中目的基因 和内参基因的表达量，采用△△Ct 的方法进行相对定量，使用转染阴性干扰载体 的样品作为对照样品，比较各瞬时转染干扰载体组样品目的基因的表达，并计算 干扰效果，shRNA-86C 的干扰效果最好，基因沉默效率60.13% ，对shRNA-86C 进行慢病毒包装。将双链的shRNA oligo插入到shRNA表达载体pENTR™/U6 vector 中，构建shRNA 表达质粒，使用Invitrogen 公司的LR 重组系统将 pENTR/U6-85-C 与慢病毒载体pLenti6/BLOCK-iT-DEST 进行重组。用 Lipofeetamine2000将构建的慢病毒表达载体 pL-85-C 和包装质粒（Packaging Mix ）共转染至生长状态良好，处于对数生长期的293T细胞，48h后收集细胞培 养上清，3000rpm 离心10 min，去除细胞和碎片，并用0.45um的滤器过滤，将病 毒原液在50000g下超速离心2小时，去除上清，重悬于500 µl DMEM培养液中， 病毒感染细胞HEK293细胞，在倒置显微镜下观察各孔中荧光细胞数，病毒滴度 为荧光细胞数除以相应的稀释倍数，测定滴度为8.8×109TU/ml ，说明有大量质粒 转入293T细胞，病毒包装成功。为研究基因沉默前后细胞生物学行为的改变和 探讨myostatin基因对双肌性状发生发展中的作用提供实验基础。 关键词：RNA 干扰；shRNA ；肌肉生长抑制素；慢病毒；qPCR 1 ABSTRACT Objective: To construct the lentiviral RNA interference (RNAi) vector of sheep myostatin gene and evaluate the effects of silencing myostatin gene expression by shRNA. Methods: Firstly retrieve purpose gene sequences in the Genebank to get myostatin sequence of sheep. Design and synthesize four pairs of oligonucleotide sequence target myostatin, and synthesize high-expression vector according to the ambion shRNA design system. Synthetic whole gene sequences, which is put into pMD-18T carrier. Find mutation points by sequencing, repair th