致病性迟缓爱德氏菌pcr检测体系的建立及其mukf毒力基因的克隆表达.pdfVIP

致病性迟缓爱德氏菌pcr检测体系的建立及其mukf毒力基因的克隆表达.pdf

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致病性迟缓爱德氏菌pcr检测体系的建立及其mukf毒力基因的克隆表达

独创性声明 本人声明,所呈交的学位(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独立 完成的研究成果,并且是自己撰写的.尽我所知,除了文中作了标注和致谢中 已作了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果.与我一 同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被 查有侵犯他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任. 学位(毕业)论文作者亲笔签名:‘二孑 日期 矿、7.( 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定,即学 校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或 部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密,在 年后解密可适用本授权书. 口 不保密,本论文属于不保密. 口 学位(毕业)论文作者亲笔签名:≯参 日期: 胪_).玉 , 指导教师亲笔签名: 、焉釉 塑塞奎苎查兰堡主堡茎 : 致病性迟缓爱德华氏菌PCR检测体系的建立及其mukF毒力基因的克隆表达 中文摘要 仅在致病性迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)国外分离株中发现的毒力基因有7种, 法根据序列设计引物。本试验确定了另外6个毒力基因在国内分离株中的分布情况,筛选出 可用于检测致病性迟缓爱德华氏菌的毒力基因,最终建立致病性迟缓爱德华氏菌的PCR检 洲体系。根据这6个毒力基因序列,设计了6对引物,经扩增结果如下:citC、fimA、gadB 和mukF均出现与目的基因大小一致的条带,经测序验证为目的条带;katB和esrB未扩增 出目的条带。为了进一步验证没有扩增出katB和esrB基因是否引物问题,引用相关文献上 katB和esrB基因引物和反应体系条件再次扩增,也未出现相应条带。试验结果显示:在citC、 fimA,gadB和mukF这4个毒力基因特异性试验中,其它常见致病菌没有扩增出与目的基 因片段大小相近的条带,引物特异性良好.各毒力基因单重PCR的灵敏度结果:gadB基因 可检测到模板浓度为loof酌止,其余3个毒力基因均可检测到的模板浓度为10pggL;二 citC/mukF。毒力基因在国外分离株中和13株国内分离株中的分布情况存在差异:gadB和 mukF在已经检测的国内分离株中均出现,其余的出现情况分别为:fimA基因出现在其中的 8株,citC基因出现在其中的7株。从引物灵敏度试验、特异性试验以及毒力基因在国内分 离株的分布情况三方面综合考虑,最终选用flmA/gadB二重PCR体系作为致病性迟缓爱德 华氏菌的检测体系.迟缓爱德华氏菌检测体系的建立对于包括鳗鱼在内的水产疾病的诊断、 防治有着重要的实际意义. mukF基因是迟缓爱德华氏菌重要的毒力基因,其功能为杀伤作用,由此克隆表达mukF 毒力基因,并籍此制备抗原疫苗,有助于预防迟缓爱德华氏菌引起的水产养殖动物爱德华氏 菌病。本试验根据已发表的迟缓爱德华氏菌mukF毒力基因序列(AY078510),设计引物 并扩增出540bp大小的片段,定向克隆至克隆载体pblue,酶切鉴定后进行序列测定和分析. 结果表明:与国外参考株(AY078510)同源性达到87.8%,分析推导其核苷酸编码的氨基 酸序列显示:氨基酸其同源性为93.3%,其编码180个氨基酸,共有12个氨基酸发生变化。 且基本均匀分布于序列中阃.将其与pET30a(+)载体构建重组质粒成功转化了BL21工 福建农林大学硕士论文 编码的约SKD的蛋白与mulcF基因编码的21KD的蛋白连接后形成的融合蛋白。融合蛋白 究迟缓爱德华氏菌毒力、致病机理以及疫苗的制备奠定了基础. 关键词致病性迟缓爱德华氏菌毒力基因PCR检测mukF毒力基因克隆表达

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