致鹅败血症粪肠菌鉴定及溶血素激活因子原核表达.pdfVIP

摘 要 1、对从通辽某祖代和父母代鹅场主要表现昏睡、持续性下痢、跛行和瘫痪 症状，呈现急性败血症病理特征的20～30日龄仔鹅心脏、肝脏、淋巴结和脑组 织液等组织分离的4株细菌，进行形态学观察、生长耐受试验、毒力因子表型试 验、生化试验等表型特征鉴定，16SrcINA检测和系统进化分析。结果接触媒试 验和发酵葡萄糖产气试验阴性、吡咯烷酮芳胺酶试验和胆汁．七叶苷试验阳性， 甘露醇、山梨醇、山梨糖等糖(醇)类发酵试验分别为阳性、阳性和阴性，精氨 酸双水解酶试验阳性。亚碲酸盐和丙酮酸盐利用试验阳性，依罗霉素敏感试验耐 药，甲基葡萄糖吡喃糖苷产酸试验阴性。乳糖、水杨素发酵试验阳性，蔗糖、阿 拉伯糖、棉子糖、木糖发酵试验为阴性。4株分离菌与参考菌株AITCC29212及 国内分离的典型菌株GU385352等粪肠球菌菌株16SrDNA的同源性均在99．0％ 以上。致病性试验小鼠半数致死量为10¨2。确定本次从鹅体内分离的4株细菌 均为中等致病性粪肠球菌，命名为TLME3株。 2、为探讨致鹅败血症粪肠球菌TLME3株毒力基因溶血素激活因子 (CytolysiIlActivator，Cy认)的变异性，研究其功能变化与基因变异的关系。本 试验根据NCBI数据库中Genbank上粪肠球菌溶血素激活因子基因序列设计特异 性引物，用PCR扩增，连接到pMDl8．T载体上，应用PCR及酶切方法检测出 阳性克隆并进行序列测定。结果TLME3的溶血素激活因子基因序列与Genbank 666bp等处有变异。结果表明，本试验成功克隆获得致鹅败血症粪肠球菌溶血素 激活因子基因，该基因高度保守，与L37110等菌株高度同源，仅个别核苷酸处 有变异。 3、为给研究致鹅败血症粪肠球菌TLME3株毒力基因溶血素激活因子的功 能奠定基础。将TLME3溶血素激活因子基因克隆到原核表达载体pET．28a(+) I、劢DI双酶切鉴定后，转化至大肠杆 中，构建pET．Cy从重组质粒，经DR R．esiIl纯化表达的 菌BL2l(DE3)中，用IPl’G诱导表达。用Higll·A瓶n时GST 融合蛋白，并进行SDS．PA(挹分离和WbStem．B10t检测分析。结果得到的溶血素 因序列同源性均在99．O％以上。SDS．PIAGE、W色毗m．Blot检测显示蛋白表达带分 子量为65．9kD，是溶血素激活因子基因表达产物。结果显示，在BL2I(DE3)中 高效表达了TL砸3株溶血素激活因子。 关键词：粪肠球菌：鹅败血症；表型特征鉴定：16SrDNA检测；致病性；溶血 素激活因子：克隆；原核表达 IdentifiedofEnterococcusfaecalisIsolatedf而m Geese Septicemia and of ActiVator Proka拶oticExpressionC”olysin Abstract Thefours旬暇．咀sof bacteri笛wereEnterococcuSiS0lated p础ogeIlic f．aecalis，恤at 丘Dm mem0凼硫ludedtestofch啪cteriStic se两ce武ageese．Tlle identific撕on，such of ofVirulence teSt t0Iemce，test f．actor，biochemical 弱obsen，ingmo印hologytest testofmolecular 6Sr【)NAdetection龇ld and∞on，and biolo幻0such弱l