猪瘟病毒e2基rt-pcr检测方法的建立及病毒分子流行病学研究.pdfVIP

摘要 病毒分子流行病学研究 预防兽医学专业：汤波 指导老师：黄伟副教授 王琴研究员 摘 要 Swine swinefever 猪瘟义称经典猪瘟(ClassicalFever，CSF)，是由猪瘟病毒(Classical E2 virus，CSFV)引起猪的高度致死性、接触性传染病。本研究建立了CSFVRT-PCR检测方 法，并采用该方法进行了CSFV在人工感染实验猪体内的组织分布研究，同时对我国部分地 区进行了CSFV分子流行病学研究。 为了建立一种准确灵敏特异的CSFVRT-PCR检测方法，并根据目的产物的序列进行CSFV 的分子流行病学研究，分析CSFV的分子遗传进化趋势。本研究通过比对GenBank公布的34 条国内外已测得的CSFV全长序列、18条牛病毒性腹泻病病毒．I(BvDVI)和6条BVDV- II基冈组全序列，避开与BVDV同源区域，在CSFV基因组E2区域设计并合成了4对引物， 后对RT-PCR反应体系各成分进行优化，建立了一套CSFVRT-PCR检测方法。采用研制的三 批CSFVRT-PCR试剂，通过对30个质控样品进行特异性、灵敏度、敏感性、稳定性和重复 RNA；重复检出率分别在91．11％．100％；同时采用欧盟猪瘟参考实验室20份标准样品进行符 合性试验，符合率达到90％，表现出高度的一致性。结果显示该方法具有良好的特异性、灵 敏度、敏感性、稳定性和重复性。 为了全面系统的研究猪瘟病毒感染后在猪体内外的病毒分布规律，指导流行病学调查采 样，本研究通过肌肉注射人工感染毒价为4X 头60日龄长白猪急性感染模型，同时设立1头阴性对照。人工感染后每天随机选择两头猪， 腋动脉放血致死，采集各组织器官和体外排泄分泌物共34种，采用上述建立的CSFvImPCR 检测方法对34种急性样品进行CSFV核酸检测，并用抗CSFVE2单抗WH303对其中22种 组织器官进行免疫组化检测抗原；同时进行临床观察、体温测定并给予进行临床计分。RT-PCR 检测结果显示，感染后第一天有7种组织器官CSFV检测为阳性，至第五天34种急性样品全 是各种与免疫相关的淋巴结和淋巴样组织，而肌肉和皮肤检出数最少；4种体外样品(粪、尿、 眼分泌物、鼻拭子)分别在3．5天内检出阳性。免疫组化检测结果显示，22种组织器官切片 中有19种观察到阳性信号，这19个组织器官与CSFVRT-PCR检测结果相符合；而皮肤、肌 肉和喉头的组织切片中未观察到阳性信号。结果表明在CSFV人工急性感染模型中，病毒感 染后能在24小时间内出现病毒血症，持续整个急性感染病程；病毒对血液和与免疫相关的组 织器官表现出更高的亲和性，并且在3．5天内开始出现体外排毒；CSFVRT-PCR和免疫组化 两种方法在急性感染模型的检测中具有较高的符合性，符合率为86．36％。上述研究对CSFV 临床诊断具有重要的指导意义，临床急性感染猪应首先采集血液和免疫器官，其次为空肠、 回肠段等组织器官。但是在对感染猪只进行处理时必须严格控制对感染猪胴体的处理，以防 止疾病扩散。 运用本研究所建立的CSFVRT-PCR对我国18省市644份疑似猪瘟样品进行检测，再将 检测为阳性的样品序列进行分析，以研究国内猪瘟流行态势和地理分布。结果644份疑似样 列同源性均在85．5％一100％之间；73株野毒以“北京、天津、河北——湖北——广东”轴东西 发散式分布在我国中东部地区；研究显示目前无基因3群流行株存在。 本研究成功建立了CSFVRT-PCR检测方法，为CSFV的临床诊断提供了重要的技术支持， 临床应用显示本研究所建立的方法也可以用于CSF流行态势的监测；同时通过对急性感染的 研究得到人工感染模型中病毒的组织分布和排毒规律，为进一步研究CSFV的致病机理增添 了新的数据。 关键词：猪瘟：RT-PCR；免疫组化；分布；遗传进化 II Abstract EstablishmentofRT-PCR