猪白细胞介素2pil-2）与猪白细胞介素6（pil-6）的基因表达及作为疫苗佐剂的研究.pdf

猪白细胞介景2(pIb一2)与猪白细胞介素6(pIL一6)的墓因表达a作为疫苗佐剂的研究 摘 要 由病毒、细菌等病原微生物侵染动物所引起的各种传染性疾病严重制约了各个 国家和地区养殖业的健康发展，同时也对人类健康存在着巨大隐患。因此，对动物 传染性疾病的防治措施研究具有重大的经济价值和社会意义。疫苗免疫是当前预防 和控制传染性疾病的主要措施，但目前使用的常规疫苗并不理想，存在免疫效率低 与安全性差的两大难题。因此，如何在安全剂量疫苗接种下提高动物机体的免疫力， 成为当今世界疫苗开发研究的热点之～。 细胞因子是由免疫效应细胞和相关细胞产生的，具有多种生物学活性的细胞调 节蛋白。它在免疫应答的产生和调节中具有重要作用，可作为新一代免疫佐剂增强 疫苗的免疫效果。二十多年来，各国学者致力于细胞因子重组蛋白作为疫苗佐剂研 究，取得了许多振奋人心的结果：多种细胞因子重组蛋白包括IL、IFN、TNF、GM．CSF 等，均能在不同程度上增加常规疫苗，包括灭活苗、弱毒菌、亚单位疫苗等的免疫 效应。近年来，将细胞因子基因作为DNA疫苗佐剂，由于其简便性与有效性，亦 受到了人们愈来愈多的关注与重视。 对象，开展了这两种细胞因子以及他们的融台蛋白(pIL6．IL2)以重组蛋白的形式 对常规疫苗PRV灭活疫苗的佐剂效应研究，及以基因形式对PRRSVORF5核酸疫 苗的佐剂效应研究。主要研究内容包括： 1．pIL-2、蕾L一6及pIL6．IL2的原核表达及纯化 coli BL21(DE3)中获得 构建pIL一2、plL．6及pIL6．IL2原核表达载体，均在E 原核表达产物均以包涵体形式产生，因此通过提取包涵体一SKL变性一透析复性的 生化提纯步骤来获取有生物学活性的重组蛋白。另将提纯了的原核表达产物rpIL一2、 rplL．6免疫家兔制备多克隆抗体。 2．plL．2、pIL一6及plL6．IL2的酵母表达及纯化 GSI 15菌株获得分 构建pIL．2、plL．6及pIL6一IL2酵母表达载体，在户pastoris 泌型表达。对3种酵母表达产物分别进行了Westernblot检测，验证为目的蛋白。通 N端糖基化修饰，rplL6一IL2则以有糖链、无糖链两种分子状态存在，之间相差约 毒性成分。对3种重组酵母菌进行了分泌外源蛋白最佳诱导时间及菌株持续稳定表 达情况分析，验证诱导培养第4、5天外源蛋白分泌量最高；只需保持一定的酵母生 长浓度，重组酵母菌可持续培养，稳定表达外源蛋白。提纯的酵母表达产物冻干活 华中农业大学博士掌位论文 性相对稳定，在4C可放置4个月以上。 3．两种体系表达产物的生物学活性测定及比较 利用IL一2依赖的CTLL一2细胞株，IL一6依赖的B9细胞株增殖试验分别检测了3 种细胞因子原核表达产物及酵母表达产物的生物学活性。结果显示两种体系的表达 产物均有生物学活性，而酵母表达产物的生物学活性要远高于原核表达产物，活性 单位相差1-2个数量级。遂选用3种酵母表达产物作为候选疫苗佐剂进行后续动物 试验。 4．开展本动物试验进行细胞因子重组蛋白对PRV灭活苗的佐剂效应研究 头份)，8周后攻毒。结果发现，rplL．2对PRV灭活苗具有很好的免疫增强效应。不 管是在免疫应答方面(包括体液免疫与细胞免疫)，还是在病毒攻击后对动物产生的 则对PRV灭活苗未表现出明显的佐剂效应。 5．连有细胞因子基因的PRRSVORF5核酸疫苗构建 确证3种质粒中的细胞园子均获得分泌性表达。 6．开展小鼠动物试验进行细胞因子基因对PRRSVORF5核酸疫苗的佐剂效应研究 BALB／c小鼠免疫两次，分别于第4、6、8周采血检Nd,鼠的中和抗体水平与 ELISA抗体水平。结果显示这3种细胞因子基因在诱导体液免疫应答方面，对PRRSV ORF5核酸疫苗均有免疫增强效应。 本研究通过开展猪细胞因子蛋白对PRV灭活苗疫苗的佐剂效应研究，以期获 得一种效果显著且又提取简便，能直接应