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犬细小病毒VP2基因的克隆、表达及其重组蛋白的抗原性研究 摘 要 犬细小病毒感染是由犬细小病毒 （Canine parvovirus ，CPV）引起的一种高度接触性传染病。 其传播速度快，发病率和死亡率高，对家犬、经济动物及野生动物危害很大。目前，该病尚无有效 的治疗方法。对其防治主要以弱毒疫苗免疫预防为主，但弱毒疫苗在使用过程中存在不安全问题， 因此，急需一种安全有效的新型疫苗来预防该疾病。由于CPV 的主要抗原位点位于 VP2 蛋白上， 因此，VP2 基因及其编码蛋白已成为研究犬细小病毒的热点。本研究工作主要包括以下四部分： 1．犬细小病毒巢式PCR 检测方法的建立及应用 从临床上疑似感染CPV的犬粪便中提取总DNA。根据GenBank 已发表的CPV特异保守的VP2基 因序列设计二对引物，扩增出目的条带，进行测序。结果表明与国际标准的CPV VP2基因序列的同 源性为99.3~ 100%。通过摸索重复性、特异性、敏感性试验，建立了巢式PCR方法。此方法具有良 好的特异性和敏感性，适合于犬细小病毒的检测和分子流行病学调查。 2 ．犬细小病毒VP2 基因的克隆及序列分析 根据 GenBank 中已发表的犬细小病毒基因序列，设计一对特异性引物，以巢式PCR 检测的阳 性样品DNA 为模板，经PCR 扩增，获得目的基因，将目的基因进行测序，结果显示，序列全长为 1755bp，其核苷酸与国外和中国各地区流行株的同源性较高，介于98.4~99.8%之间，表明本研究成 功克隆了CPV VP2 基因。 3 ．犬细小病毒VP2 基因的原核表达及免疫反应性研究 成功构建重组原核表达质粒pGEX-4T-VP2 ，用克隆的CPV VP2 基因转化到E.coli BL21 中，经 IPTG 诱导表达，SDS和Western-Blotting 分析，结果表明，诱导表达的pGEX-4T-VP2 阳性 菌株可表达出大小为90kDa 蛋白，该重组蛋白具有反应活性。 4 ．犬细小病毒VP2 基因的原核表达条件优化和蛋白纯化及免疫原性研究 为了确定VP2 基因蛋白在大肠杆菌E. coli BL21 (DE3) 中表达的最佳条件，对诱导温度、诱导 时间及IPTG 浓度等条件进行优化。用Glutathione Sepharose 4B 亲和层析柱纯化出目的蛋白。 纯化的目的蛋白四次免疫小白鼠，ELISA 结果显示 GST-VP2 融合蛋白抗血清效价随着免疫次 数的增加而升高，表明得到的重组蛋白具有很好的免疫原性。可作为犬细小病毒的基因工程亚单位 疫苗候选者。 关键词：犬细小病毒；VP2 基因；原核表达；免疫活性 I Study on Cloning and Expression of VP2 Gene of Canine Parvovirus and Antigenicity of Its Recombinant Protein Abstract Canine parvovirus (CPV) infection is a kind of serious contagious transmission disease, which is caused by CPV and spreads very rapidly. And its rate of infection and death are also quite high. So it caused big damage in dogs, economic animals and wild animals. Nowadays, there is no remedial method for its infection. Clinically, preventive measures against CPV are mainly dependent on attenuated vaccine, however, there are some certa