单增李斯特氏菌相核酸探针检测方法的建立与初步应用.pdfVIP

单增李斯特氏菌液相核酸探针检测方法的建立与初步应用 摘要 李斯特氏菌(Listeria)在自然界分布广泛，可来源与土壤、水、植物和反刍动物、人 的粪便，极易污染各类食品。该属中的单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes， 以下简称单增李斯特氏菌)主要侵袭孕妇、新生儿、免疫功能低下成人，特别是老年人， 更可导致人和动物患脑膜炎、败血症、流产等，病死率高达30％～70％，是目前最重要的 人类食源性病原菌之一。国内外对单增李斯特氏菌均给以高度重视，WHO将其列为21 世纪对中国人卫生健康具有重大影响的12种病原微生物之一，并建立了单增李斯特氏菌 食源性疾病报告系统。 传统单增李斯特氏菌检测方法，主要是常规增菌培养后在进行生化鉴定，检测过程耗 时4-10天，费时费力，难以适应快速检验的要求。免疫法比较快，但单克隆抗体制备比 较困难，易产生交叉反应，特异性差。而PCR方法快速特异，灵敏度很高，但由于死菌 中的DNA降解较慢，也容易产生假阳性。前增菌可以部分减少PCR检测时出现的假阳性， 但增加分析时间，且当死菌含量增多时，用PCR结合探针仍可以检测到假阳性信号。因 此，研究～套高效可行的检测方法显得十分必要。 本实验主要应用新近发展起来的基因探针方法快速检测食品中单增李斯特氏菌，简 化了检验流程、提高检测效率，并探讨了其在禽肉类样品检测中的应用。选择单增李斯特 5．0，Oligo 氏菌同源性较高的致病基因hlyA，利用Primer 探针，探针大小21bp，具有寡核苷酸探针的优点。此方法利用化学发光物质吖啶酯标记 寡核苷酸探针，所设计的探针能够与目的核苷酸片段杂交，形成DNA．RNA杂交体，杂交 后无需分离步骤，利用差分水解(Differential 经杂交的发光探针失去发光特性(半衰期小于1rain)，而与靶细胞杂交的探针可以保护 吖啶酯不在碱性环境下水解。由于吖啶酯平面结构镶嵌于杂交体双螺旋的内部，受到空间 行检测时，能够再发光仪上检测到发光，整个试验过程只需要30分钟。此方法称为核酸 杂交保护分析，目前在我国还很少应用。 取单增李斯特氏菌标准株的纯培养菌进行核酸杂交保护分析的试验，通过条件的筛选 和优化，此方法能够特异性的检测出单增李斯特氏菌，而对绵羊李斯特氏菌，空肠／结肠 弯曲菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌、绿脓假单胞菌等非单 增性李斯特氏菌均检测为阴性结果。挑取不同个数的阳性菌落进行敏感性试验，最低检测 限度为2个阳性菌落(10cfu／mL)。 将建立的液相核酸杂交保护分析方法应用于送检的100份鸡肉样品的检测，在分离培 养的过程中，对纯培养菌落进行核酸杂交保护分析检测，并与常规生化鉴定结果对比，核 应用结果显示，本研究所建立的液相核酸探针检测单增李斯特氏菌的方法具有简便、 快速、准确、可靠的优势，有广泛的应用价值。 关键词：单增性李斯特氏菌，核酸探针，检测，应用 Acid Establishmentand of PhaseNucleic ApplicationLiquid MethodstoDetectListeria monocytogenes Abtract Listeriais asoil．．borne theenvironment． dispersedthroughout primarily microorganism insuchsourcesas Listeria beenfound monocytogenes(L．monocytogenes)has