奶牛附红细胞体pcr检测方法的建立及其病原生物学初步研究.pdfVIP

广西大学硕士论文 奶牛附红细胞体病PcR检测方法的建立及其病原生物学初步研究 奶牛附红细胞体病PCR检测方法的建立及其病原生物学初步研究 摘要 奶牛附红细胞体病是一种日益受到人们关注的人畜共患病，病原是牛 温氏附红细胞体。该病近年来给我国养牛业造成了较严重的经济损失。针 对目前国内还尚未在分子水平上证实该病原的存在，对其分类学地位不清 楚及镜检作为检测该病普遍采用的方法存在许多不足等情况。本文对奶牛 附红细胞体的16SrRNA基因进行了克隆、测序，并依此建立系统发肓进化树， 旨在从分子水平上确定其分类学地位。并且根据所得16SrRNA基因序列设计 引物，建立了奶牛感染附红细胞体的PCR诊断方法。 果表明，目的片段长度为1439bp，其核苷酸序列与国外已发表的牛温氏附 红细胞体(Ewenyoni)的16S rRNA基因片段同源性高达97．1％，暂称为 中国广西株(￡wenyoni-OGX／)；系统发育进化树显示，Ewenyon／一CGX 和其它血营养菌在系统进化关系上组成了一个大的进化分支，与支原体科、 支原体属的病原最接近(75％)，而与立克次氏体科的病原较远(55％)。分 析结果支持了Neimark等和Messick等提出的将这类血营养菌划归入支原 体科、支原体属的建议。 同时．根据测序得到的奶牛附红细胞体16SrRNA基因序列，设计一对种 奶牛附红细胞体病PCR检测方法的建立及其病原生物学初步研究 特异性引物，建立奶牛附红细胞体病的POR诊断方法。特异性试验和敏感 性试验表明，该诊断方法与猪肺炎支原体、鸡毒支原体、大肠杆菌、肠道 沙门氏菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝斯焦虫无交叉反应；能 在4*0存放长达三个月的血样。通过临床血样检测，证明该方法可以用于 本病的诊断。 另外．建立了奶牛附红细胞体病和伊氏锥虫病的二重POR诊断方法，其 方法与猪肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌、鸡艾美耳球虫、牛双芽巴贝 斯焦虫无交叉反应；能检测的奶牛附红细胞体阳性血液．DNA最低浓度和伊 氏锥Rllfl’A 明，该方法可用于奶牛附红细胞体病和伊氏锥虫病的诊断。 为了初步探索不同种动物附红细胞体之间是否存在交叉感染，本研究 ／ 首先摸索体外培养水牛红细胞的最佳条件，然后用染色镜检为附红细胞体 阳性的人、奶牛、小白鼠、狗、猫和兔红细胞在体外感染阴性的水牛红细 血清40％的完全培养基可用于水牛红细胞的培养，在体外可以成功培养长 达30天；在体外交叉感染试验中，奶牛和猫的附红细胞体最易感染水牛， 为兔，感染率只能达到15％，而人的附红细胞体在体外不能感染水牛红细 胞。 本研究通过对不同种动物附红细胞体血液涂片染色、体外培养及体外 广西大学硕士论文 奶牛附红细胞体病PCR检测方法的建立及其病原生物学初步研究 交叉感染，一定水平上反应了不同种动物附红细胞体间的生物学联系与区 别。通过对奶牛附红细胞体16SrRNA基因序列进行系统发育进化树分析， 阐明了奶牛附红细胞体的分类学地位。所建立的特异性奶牛附红细胞体病 性好，敏感性高，准确快速，为奶牛附红细胞体病和伊氏锥虫病的分子流 行病学调查、防制及病原学研究奠定了基础。 关键词： 交叉感染 广西大学硕士论文 奶牛附红细胞体病PCR检测方法的建立及其病原生物学初步研究 DEVELOPMENTOFAPCRDIAGNOSTIC ASSAY FOREWENYONIINFECTION ANDITS PATHOGENYPRIMARY