微丝在成骨细胞学敏感性恢复中的作用.pdfVIP

The role of F-actin in the recovery of mechano-sensitivity in osteoblasts A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Doctor’s Degree of Science By Gong XiaoYuan Supervised by Prof. Pan Jun Specialty：Biomedical engineering College of Bioengineering of Chongqing University, Chongqing, China October 20 13 中文摘要 摘 要 骨组织的大小、形状以及内部结构受到力学刺激的调控。成骨细胞，作为骨 组织内的力学感应单元之一，对存在于骨组织中流体剪应力（FSS ）刺激具有力学 敏感性，并在 FSS 刺激作用下对骨组织产生促生成的作用。近期的研究表明，骨 组织在持续的力学加载中逐渐的丢失对力学刺激的敏感性，而插入的间歇时间能 够促使其力学敏感性恢复，但相关细胞水平的机理尚不明了。结合成骨细胞细胞 骨架中的微丝 （F-actin ）与细胞内钙离子信号的双向调控作用，本文设 F-actin 强 度在成骨细胞受到单向稳定流体剪应力（sFSS ）加载后力学敏感性的恢复过程中 起主导作用。 为了验证这一设想，我们首先使用 MC3T3-E1 成骨细胞以及骨髓充间质干细 胞（BMSCs ）作为研究对象，并对其进行10dyn/cm2 的sFSS 加载，在休息不同的 时间（0，10 以及30 分钟）后对其进行再次加载。我们发现在加载后插入30 分钟 的间歇时间能够使得两种细胞的力学敏感性得到恢复。通过使用 MC3T3-E1 细胞 作为重点研究对象，对其进行3 分钟 sFSS 加载，在休息0，10 以及30 分钟后对 其进行再次进行相同的sFSS 加载，我们发现插入长期间歇时间的加载相对于插入 短期间歇时间的加载以及持续加载的力学加载在碱性磷酸酶活性的提升上作用较 明显，且细胞的力学的敏感性呈先下降后升高的趋势：细胞在休息0，10 以及30 分钟后相对第一次加载的钙峰倍数增加分别恢复了0%，79.7% 以及112.2%，而响 应率分别恢复了0%，37.5% 以及137.5%。通过结合使用阻滞剂对力学敏感型通道 进行阻断的实验数据，我们发现力学敏感型通道的开放程度在此过程中起主导作 用：细胞中力学敏感型通道在第一次加载时以及不同间歇时间（0，10 以及30 分 钟）后对钙离子信号钙峰倍数增加的贡献率分别为48%，0%，33.3% 以及57.6%； 对响应率的贡献率分别为27.3% ，0%，18.5%以及41.9% 。通过对相应时间点细胞 中F-actin 进行染色，我们发现首次加载后F-actin 的强度呈先上升后下降的趋势； （细胞中连续的F-actin 的密度由加载前的 8.21±4.25 升高至 sFSS 加载后的 15.25±2.26，加载后休息 10 分钟后细胞中F-actin 的密度显著增加为35.28±1.91， 随着间歇时间延长至30 分钟，F-actin 的密度降低至15.33±1.23）。结合鬼笔环肽 （Phalloidin （Phall ）），一种F-actin 的稳定剂对F-actin 聚合/解聚合作用的抑制后 测得的钙离子信号数据，我们认为，成骨细胞细胞骨架中的F-actin 通过调控成骨 细胞中力学敏感型通道开放程度参与了细胞力学敏感性的恢复。 为了进一步验证细胞骨架中微丝对成骨细胞力学敏感性调控作用，我们使用 前列腺素E （PGE ），一种具有促进骨生成作用的调控分子对成骨细胞进行处理， 2 2