全新HPLC演示文稿.ppt

（三）柱外效应和“无限直径”效应 1.柱外效应 柱外效应指由色谱柱以外的因素引起的色谱峰扩张的因素。 柱外因素常指从进样口到检测池之间，除色谱柱以外的所有死 空间，如：进样器（ Ⅰ ）、连接管（C）、检测器(D)等的死 体积，都能导致色谱峰展宽、柱效下降。总的柱外效应（OC） 引起峰扩展所提供的方差应为各独立因素提供的方差之和。 (1)进样器死体积因素引起的峰扩张方差 VⅠ：进样体积 （2）毛细管连接管死体积因素引起的峰扩张方差 dc：连接管内径；l:连接管长度； F：流动相流量；DM：溶质的扩散系数 （3）检测器的死体积因素引起的峰扩张方差 VD:检测池体积。通常检测池体积小于色谱峰洗脱体积的十 分之 一 ，检测池死体积产生的柱外峰扩张就不明显。 马丁（Martin A. J. P.）提出允许检测池的最大体积为： 柱外效应存在的直观标志，可由k小的组分（ k ＜3 ）的峰形脱尾或峰宽增加而呈现出来。也可通过 绘制H-u曲线看出， k小的组分的H-u曲线形状与k大 的组分明显不同。此外，非保留峰的理论塔板高度 大于保留峰时也是存在柱外效应的一个明显标志。 2.“无限直径”效应 （1）“无限直径”效应 当溶质以点进样方式注入色谱柱后，溶质在色谱柱中的分 子扩散很小,因而产生从样品注入中心起直至样品离开柱的整个 分离过程中样品分子不接触柱内壁的现象。 “无限直径”效应的存在是获得高柱效的有利因素。 （2）产生“无限直径”效应的原因： 是溶质注入柱中心后，在流动相驱动下沿纵向运动的同时， 产生非常慢的径向扩散。 诺克斯提出了描述径向扩散产生径向峰宽的方程如下： dp:固定相粒度；Z：溶质沿柱方向运行的长度（柱长）； DM:溶质的扩散系数；u：流动相平均线速度； wi：进样延迟引起的谱带扩展初始宽度 通过计算和实验已证明：内径为4.6mm，柱长 为10～25cm的色谱柱都可保持“无限直径”效应，理 论塔板数(n)可达5×103以上。 拉而德（Laird G. R.） 等人证明：当溶质达到 柱内壁时，柱效显著下降， “无限直径”效应丧失， 塔板高度增加2～3倍。 第三节 分离度及影响因素 一、衡量色谱分离条件优劣的综合指标——分离度R Detector Response Time A B W W A B Inject t0 tR(A) tR(B) 不同R值的色谱峰重叠情况 注意：R=1.5的两个相邻色谱峰可以达到满意的基线分离 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1.00 1.25 不同分离度比较 Poor efficiency Moderate selectivity Poor efficiency Good selectivity Excellent efficiency Poor selectivity Excellent efficiency Moderate selectivity R = 1 R = 1.5 R = 0.5 R = 4 二、HPLC法中影响分离度的因素 色谱的分离方程可用下式表示： 柱效项 柱选择项 柱容量项 理论塔板数n 选择性系数α 容量因子k 这样我们可看到分离度是三个因素的函数，即柱效n、分配 系数比α和容量因子k。此方程在高效液相色谱法中及其重要， 它可以把三个参数和它们对分离度的影响联系起来。做为初步 近似，这三个参数可以独立变化。如下图： (A) (B) 由图A得出：k 改变，峰位改变； n改变，峰宽窄改变； α改变，峰间距改变； B图表示了三种分离不好的情况： （a）容量因子k较小，应在适当范围增加容量因子（1＜ k ＜10）。 （b） k合适，但分离度仍较差，应提高柱效（n增加）。 （c）两组分分配系数比α几乎为1，只能改变α。 1. 容量因子（ k ）对分离度的影响 HPLC法中，k≈1～10。分析时间恰好合适 如何改变k： HPLC法：主要通过改变流动相的极性（极性强度）。