一种烟草普通花病毒拮抗细菌活性物质的分离纯化及其作用机制研究.pdf

摘 要 植物病毒病是农作物的重要病害之一。目前，抗植物病毒剂的防治效果或安全性还不理想， 远远不能满足农业的需求，急需开发新型抗病毒制剂。尽管化学农药现在仍占主体，但从可持续 发展的角度考虑，发展能产生高效、高活性的生物源抗病毒剂是实现产业化生物防治中的关键任 务。对我国来说，微生物来源的生物化学农药是生物农药发展的主体。 本研究首先从春季及夏季烟草的病、健叶、种子及土壤中共分离剑127个菌株，摇瓶发酵后， Mosaic 分别取发酵液，室内经、卜叶法测定其对烟草普通花叶病毒(TobaccoVirus，TMV)的拮抗 作用，得到一个对TMV有很强拮抗活性的细菌菌株，根据生理生化特性和16SrDNA序列鉴定 为荧光假单胞菌(Pseudomonas 菌株发酵液中的抗病毒活性物质为蛋白质，命名为CZp。并对拮抗细菌CZ产生活性物质的摇瓶 发酵条件进行了初步研究。研究表明，CZ菌株适宜的摇瓶发酵条件是：NB培养基、初始pH8．0、 通气量30mFlOOml、发酵温度25℃、发酵时间60h。 同时，本研究对活性蛋白CZp进行了分离纯化。利用硫酸铵分级沉淀获得粗提蛋白，并通过 发酵液经硫酸铵粗沉淀及预处理后，采用离子交换层析和分子筛层析等方法对活性物质进行了纯 化，经SDS．PAGE测定其亚基的相对分子质量为13．5kD，并对其部分理化特性进行初步分析。 结果表明：拮抗活性蛋白CZp稳定性较好，对酸、碱较敏感，不能忍受强酸强碱的环境条件；对 温度不十分敏感，但是不能忍受长时间的持续高温；对光照不敏感，但随着光照时间的增长，活 性略有下降；对蛋白酶K和胰蛋白酶均不敏感，用两种酶处理后，仍能保持原有的活性。 tabacum 此外，本研究以枯斑三生烟(Nicotianatabacumvar．samsunNN)和普通烟(Nicotiana 的作用机理，主要得到以下结果： CZp具有抑制TMV在烟草体内复制增殖的能力。叶圆片法试验结果表明，研磨接种后，在 CZp粗提液中悬浮的圆片比在蒸馏水中悬浮的枯斑数降低89．19％，说明CZp对病毒在烟草体内 的复制增殖有一定的抑制作用。 CZp具有诱导寄主对TMV产生系统抗性的能力。用CZp对枯斑三生烟卜．部叶片进行诱导处 理(清水处理作对照)，然后在其上部叶片接种TMV。结果表明，CZp可以诱导枯斑三生烟对 TMV产生系统抗性，其中以诱导处理第4大的枯斑抑制率为最高，可达81．76％，枯斑出现时间 推迟10h以上。 片中的POD及PAL等细胞防御酶活性增强。 素的含量。结果表明，经CZp处理的NC89烟叶片内MDA的含量降低，而叶绿素的含量增高。 电镜观察结果表明CZp能打破TMV粒体的规则排列，与TMV粒体不可逆的结合，从而降 低其侵染能力。 关键词：拮抗细菌，活性蛋白，分离，纯化，作用机制 Abstract con订ol Thevirusdiseaseisonemaindiseaseon effectsand ofantiviral crops．The security agent arenotaS as demandstjllnow．Newantiviralareindireneedof goodpeople’s agents researching． antivirus with and isthe missionof disease efficiencyhigh Developingproductshigh activitykey plant for chemical biocontr