利用酵母双杂交统研究水稻条纹病毒与寄主水稻之间的互作.pdf

摘要 摘要 近年来，由水稻条纹病毒(Rice stripe，衲口，RSV)引起的水稻条纹叶枯病在各地爆发流行， 已经成为我国水稻(Oryr．asativa)生产上的重要的病害之一，给农业生产造成了严重的危害。国 内外学者对RSV的生物学和分子生物学进行了广泛系统的研究，明确了水稻条纹叶枯病的地理 分布、症状、病原性质、血清学、致病性分化、分子变异、细胞病理学及品种抗性等，但是对于 该病毒一些蛋白的功能、病毒的致病机制及寄主对病毒的抗感病作用机制等尚不清楚。因此，从 分子水平上研究病毒蛋白及其与寄主蛋白之间的互作关系，对于阐明上述诸多问题具有重要的意 义。 营养缺陷型培养基上检测CP、sP和NSve4蛋白对酵母细胞的毒性和自激活活性。将重组子两两 共转化到酵母菌AHl09中，于不同营养缺陷型培养基上检测RSVCP、SP、NSve4三个蛋白自身 现出毒性和自激活活性，酵母双杂交结果显示RSVCP蛋白自身能够发生互作，而SP、NSve4 测到互作现象． 提取对RSV抗性差异显著而遗传背景基本一致的两个水稻品种(品系)“武育粳3号一和 文库．文库质量鉴定结果表明：所构建的两个文库库容量均大于1．0X106efu，初始文库滴度分 别为1．ox 10u ioloefu／mL和5．0X1010ef-u／mL，扩增文库滴度为1．0Xcfu／mL。两文库重组率均大 于95％，。武育粳3号一文库eDNA插入片段长度集中分布在700-800 bp之问，搿KT95-418一集 中分布在750-1，000 bp之间．小规模测序结果表明两文库中全长基因的比例均超过60％． 的酵母菌AHl09中，转化产物涂布不同营养缺陷型培养基，筛选可能与诱饵蛋白互作的阳性克 隆。PCR鉴定阳性克隆子中eDNA插入片段的大小，将含有不同长度插入片段的酵母质粒分别 寻找同源序列．根据同源序列的注释信息，分析所筛选的阳性克隆菌落中eDNA插入片段的大 小、序列完整性、读码框正确性等。结果表明，以不同的诱饵筛选不同的eDNA文库获得了不 同种类和数量的阳性克隆：以RSVCP为诱饵，从“武育粳3号挣文库中筛选获得4个不同的阳 性克隆；以RSV SP CP为诱饵，从。KT95-418一文库中筛选获得2个不同的阳性克隆：以RSV 为诱饵，从●武育粳3号一文库中筛选获得5个不同的阳性克隆；以RSVSP为诱饵，肿KT95-418一 文库中筛选获得6个不同的阳性克隆；以RSVNSve4为诱饵，从“武育粳3号一文库中筛选获 利用酵母双杂交系统研究水稻条纹病毒与寄主水稻之间的互作 一 性克隆。根据数据库中阳性克隆对应同源基因的功能注释，并结合已有文献对该互作蛋白的研究 报道，初步推测了蛋白互作在RSV致病和寄主对病毒侵染应答过程中可能发挥的作用· 其基因全长并进行测序鉴定．结果表明，扩增获得了NB2和NB5全长基因，而CW$扩增产物 较之数据库同源序列要短．将全长NB2和NB5构建到酵母双杂交捕获载体r，GADT7上获得了重 和NB5全长基因表达产物与RSV 白均能与NSvc4发生互作，而与CP、SP不具有互作关系。 为了进一步验证上述利用酵母双杂交系统检测蛋白互作的实验结果，又分别以重组子 SP和 和pKYLX71：35S2载体。重组质粒转化农杆菌(Agrobaeterium 杆菌注射液并注射本氏烟(Nieofianabenthamiana)，使外源蛋白在本氏烟叶片中瞬时表达。提取 blot检测，确定蛋白的互作情况。检测结果与酵 电泳后，以c-Myc抗体或HA抗体进行Western 而未检测到CP、SP与NB5之间存在互作关系。 Tnne