柑桔衰退病毒p5、p27和p20基因的克隆及生物信息学分析.pdf

摘 要 柑桔衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)是一种具有经济重要性的病害，广泛分布于 世界各柑桔产区，对世界柑桔产业造成了严重威胁。CTV主要通过嫁接和蚜虫传播流行，褐 色桔蚜(Toxoptera 组为19，296个核苷酸组成的正义单链RNA，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒，具有 中发挥重要作用，并且p25被认为与crv致病性有关，为了更多了解这三个基因及其蛋白的 信息，本研究应用反转录．聚合酶链式反应(RT．PCR)扩增，克隆上述三个基因全长，应 用生物信息软件和生物信息网站分析其碱基组成，建立其系统进化树，预测其蛋白的等电点、 二级结构和跨膜区，为进一步进行基因原核表达蛋白，制备CTV编码蛋白特异性抗体，深入 进行桔蚜传播CTV及其致病机理研究提供了基础数据。 1．构建了三个基因的克隆载体CTV·p25、CTV·p27和CTV·p20 产物经回收纯化后连接到克隆载pTA-2上，转化Ecoli菌株DH5a，利用氨苄青霉素抗性及a一 I酶切鉴定，获得到三种重组质粒，分别命名为 互补筛选阳性菌落进行菌落PCR和EcoR a CⅣ-p25、CⅣ·p27和Crv—p20 2．基因序列碱基组成分析 用DNAStar软件对三个基因序列碱基组成进行分析，编码两个外壳蛋白的p25和p27 20．77％ 3．聚类分析 与GenBank收录的9个已测全基冈序列的CTV分离株的相同的三个基冈进行核酸和氨基 p27和p20的氨基酸进化树与其核酸进化树反映的各分离株之间的亲缘关系基本相同。 4．三个蛋白氨基酸组成和等电点预测 p25编码223个氨基酸，其中强碱性氨基酸有31个，强酸性氨基酸有30个，疏水氨基 7．0时带有1．329个正电荷。 酸73个，极性氨基酸61个。p25等电点为7．831，pH p27编码241个氨基酸，其中35个强碱性氨基酸，34个强酸性氨基酸，74个疏水氨基 酸，63个极性氨基酸。p27等电点为7．753，pH7．0时带有1．475个负电荷。 p20编码182个氨基酸。其中强碱性氨基酸有21个，强酸性氨基酸有22个，疏水氨基酸68 7．0时带有0．061个负电荷。 个，极性氨基酸45个。p20等电点为6．979，pH 5．三个蛋白二级结构预测 p25和p27两个外壳蛋白的二级结构以无规则卷曲为主。面D的二级结构以Q螺旋为主。 6．三个蛋白的跨膜区分析 p25氨基酸序列的170．191位可能形成一个从里到外的跨膜螺旋结构、170．194可能形成 一个从外到里的跨膜螺旋结构；p27氨基酸序列的17-33位之间可能形成跨膜的螺旋；p20蛋 一个从外到里的螺旋，氨基酸序列为96-116位。 关键词 柑桔衰退病毒p25p27p20克隆生物信息学分析 Abstract Cifrustristeza acausal ofthemost diseasesof virus(cry)isagent economically important inthecitrus alloverthe worldand thecitrusin— citrus，distributingproductionregions threatening RNA tothe dustryseriously．CⅣthelargestplant virus，belongsgenus iridae tonewareas infected tressand then family,dispersedmainlyb