荧光原位杂交技在大白菜染色体基因定位中的应用研究.pdf

摘要 大白菜不仅是起源于中国的重要的蔬菜作物，而且是多国芸薹属基因组计 划的主要研究对象之一。基因定位是基因鉴定、克隆和利用的基础和前提。在 分子细胞遗传学研究领域，利用非整倍体材料和荧光原位杂交技术手段进行基 因的物理定位，日益成为基因定位研究的热点，这对物理图谱的绘制、建立遗 传连锁群和特定染色体的对应关系以及遗传图谱和物理图谱的整合具有重要的 意义。本研究以大白菜二倍体和本课题组创制的一套大白菜初级三体为材料， 采用染色体核型分析的方法对继代繁殖多代的不同三体和二倍体的遗传稳定性 进行了细胞学鉴定，采用FIsH技术对两个rDNA重复序列基因和通过PcR扩 增、克隆获得的几个功能基因片段进行了物理定位。主要研究结果如下： 1．通过对FIsH的相关技术参数的研究，建立了大白菜染色体制备和制片 预处理、探针杂交、杂交后洗脱以及信号检测的技术体系。以重复序列45srDNA 为探针，利用该体系在大白菜中期和问期染色体上成功检出了10个荧光强度强 弱不同的杂交信号，为荧光原位杂交技术在大白菜上的利用奠定了基础。以幼 嫩子叶为材料，采用低温刀切的方法，改进了fibe卜FIsH技术过程中细胞核的 提取方法，成功的制备出了平滑伸展的DNA纤维，大白菜基因组探针在DNA 纤维上杂交，杂交信号为非连续的念珠状长链。 核型类型为2B。1号、2号、4号、5号、7号为中部着丝点染色体；3号、6号、 8号、9号染色体为近中部者丝点染色体；10号染色体为近端部着丝点染色体。 DAPI显带结果表明深染区多集中在着丝粒两侧附近，同源染色体的带纹数目、 分布位置基本一致。 3．通过对大白菜组培苗根尖细胞有丝分裂染色体数目观察，发现长期继代 保存的一些材料存在着染色体数目的变异；但对不同三体进行核型分析可知， 染色体数目未变异的三体株系仍为最初确定的三体，没有发生染色体的置换。 4．拟南芥25SrDNA在二倍体大白菜中期染色体上的FISH定位表明存在 着5个25srDNA的同源区段，它们分别位于1号、2号、3号、4号和10号五 fiber-FIsH 对染色体上。杂交信号在不同染色体上的荧光强度不同。利用DNA 在大白菜不同初级三体上检出的杂交信号的个数在7．12个之间变化，分布于4．7 个同源区段上。综合分析可以看出，在不同三体的1～4号染色体的长臂及10 rDNA的同源区段，但杂 号染色体的随体(包括次缢痕处)上均存在相应的25s 交信号在不同三体同一染色体上检出的频率不同，荧光信号强度也有变化，最 强的信号出现在不同三体的#10随体染色体上(tripl04，tripl05除外)。 5．5srDNA在二倍体大白菜检出了6个杂交信号，分别位于2号染色体的 三个三体上分别检出了7个、6个和7个杂交信号，这些信号所属的染色体和在 rDNA 染色体上分布的位置与二倍体相同。利用DNAfiber-FISH技术确定了5S 在大白菜基因组中的拷贝数约为679。 6．利用25S和5SrDNA为探针，可以准确识别大白菜1号、2号、3号、 4号、9号和10号染色体。 7．通过PcR扩增、克隆获得了14个大白菜功能基因同源片段，根据其片 序列比对结果表明所获的这些基因同源片段的核苷酸序列与供选基因的核苷酸 和CYP954四个探针各在二倍体大白菜一对染色体上检出了F1SH杂交信号，分 别位于3s中部、3L中部、2L末端以及1L中部，尽管四个探针信号检出率都 较低，平均为6．48％，但低拷贝基因在大白菜染色体上的定位尚属首次，为大 白菜单／低拷贝功能基因的定位和与其它物种的比较研究奠定了基础。 关键词：大白菜：荧光原位杂交；初级三体；fiber．FISH；rDNA基因；基因克隆 ApH毛ationstudiesof inGenes Fluorescence伽sfm协6r以拓口“D，l-I’echnique LoSa2ationonlbechromosomesofchinese