水稻细胞分裂素元信号系统分析及反应调节因子的分子调控研究.pdf

lIilll1 1 IIIIIIII II IIIIl ＼1735377 摘 要 细胞分裂素是一种常见的激素，调节植物各种生长和发育过程，如细胞分裂、 顶端优势、叶绿体生物合成、根和叶的分化、叶片衰老、养分信号以及芽的形成。 研究表明在原核和真核生物中都存在着一种细胞分裂素双元信号系统，生物体可 以通过此系统感知外界环境的刺激并作出应答反应。目前对双子叶模式植物拟南 芥的细胞分裂素双元信号系统已经有了深入的研究，但是对单子叶植物的细胞分 裂素双元信号系统的了解还十分有限。本研究利用牛物信息学的方法对水稻细胞 分裂素双元信号系统基因进行分析，并对细胞分裂素反应调节因子 OsRR3．OsRR6基因过量表达以及RNA干涉的分子调控进行了研究，获得如下主 要结果： l、通过生物信息学分析了水稻细胞分裂素信号传导系统基因，并与拟南芥和玉 米进行比较，研究发现，水稻的双元信号系统中大部分基因的序列高度保守，都 包含磷酸传递所必须的氨基酸残基，与拟南芥、玉米不存在明显差异。系统进化 树分析显示水稻和玉米在双元信号系统基因进化上比拟南芥更近。染色体定位分 析发现，水稻双元信号系统基因的染色体的分布与拟南芥、玉米相似，呈现分散 分布，没有分布热点染色体。基序分析表明，水稻各大类基因基序高度保守，但 存在着一定程度的冗余现象，这可能是由于基因复制导致的结果。 量表达载体，利用农杆菌介导的方法获得了过量表达OsRR3．OsRR6基因的转基 因水稻，通过细胞分裂素敏感性试验筛选出OsRR3和OsRR5两种转基因水稻为 研究对象，建立了转基因植株拷贝数实时荧光定量PCR快速检测体系。利用该 体系筛选出单拷贝T3代转基因株系。 3、过量表达OsRR3和OsRR5基因的T3代转基因植株在外形上与野生型植株没 有明显差异。但在外源激素的处理后，转基因植株表现出对外源细胞分裂素的不 敏感性，主要表现在与未转化植株相比，其主根长与侧根数受抑制程度小、愈伤 组织形成缓慢、黑暗诱导后叶片中叶绿素含量降低速度快。 通过水稻反应调节因子对外源细胞分裂素6-BA处理的响应分析发现， 种B型反应调节因子在水稻的根部和叶片中没有表达，OsRRll表现出根部的组 织特异性表达。未转化植株中所有A型反应调节因子受外源细胞分裂素诱导后 表达量显著上升，而过量表达OsRR3和OsRR5转基因植株中大部分A型反应调 节因子基因的表达量在有外源细胞分裂素诱导的情况下受到抑制，但是OsRR2、 OsRR4和OsRR6这三种A型反应调节因子基因的表达量出现上升。在转基因植 株和未转化植株中所有B型反应调节因子的表达量没有发生变化，说明B型反 应调节因子不受外源细胞分裂素的诱导。研究结果表明两种A型反应调节因子 OsRR3和OsRR5在水稻细胞分裂素双元信号系统中对其他A型反应调节因子主 要起到负向调控的作用。 并构建干涉表达载体，利用农杆菌介导的方法将OsRR3．OsRR6基因RNA干涉 表达载体转化水稻中花1l，通过转基因株系的筛选，最终获得了OsRR6基因的 表达量明显降低转基因株。 5、通过对RNA干涉OsRR6基因的T3代转基因植株与野生型植株农艺性状进行 比较，结果未发现明显差异。在外源细胞分裂素诱导的情况下，转基因植株与野 生型植株相比表现出对外源细胞分裂素的超敏感，主要表现在与未转化植株相 比，其主根长与侧根数受到显著抑制、愈伤组织受诱导后形成速度快、黑暗诱导 后叶片中叶绿素含量降低速度慢。 通过水稻双元系统途径基因对外源细胞分裂素6-BA处理的响应分析发现， 调节因子以外，其它全部A型反应调节因子的表达量相对于未转化植株出现了 明显的提高。在转基因和未转化植株中，细胞分裂素受体OsHKs的表达量受诱 导后都显著增强，而OsHPs和B型反应调节因子都不受细胞分裂素诱导。结果 表明干涉OsRR6基因只能对其他A型反应调节因子的转录表达进行调控，不能 细胞分裂素双元信号系统中起到负向调控的作用。 关键词：水稻，细胞分裂素，双元信号系统，反应调节因子，过量表达，RNA 干涉 II Abstract areaclassof