野苋菜凝集素基的克隆及转基因研究.pdf

野苋菜凝集素基因的克隆及转基因研究 摘要 蚜虫属同翅目昆虫，种类繁多，侵害目标广泛。它通过口器深入植物的 韧皮部吸收营养，并携带和传播病毒，造成农作物的产量和品质的下降。植 物抗虫基因工程为控制害虫的危害提供了新的途径。随着越来越多的抗虫基 因被导入植物以提高植物的抗虫能力，人们发现：寻找新的高效抗虫基因， 仍是现阶段抗虫基因工程的关键；对植物抗虫能力的提高不能单单依靠某个 抗虫基因的转入就能实现；抗虫基因在转基因植物体内表达不稳定甚至出现 转基因沉默；等等。基因融合可以使多个抗虫基因协同作用，提高植物的抗 虫能力和抗虫谱并实现基因同步表达，并以完全独立的不同的杀虫蛋白的形 式发挥活性，因此在植物抗虫基因工程中有很高的利用价值。此外，利用MARs iXattachment 序列(Matr 活的一种有效策略。 本研究采用同源扩增PCR技术，从苋属的野苋菜中分离和克隆新的苋菜 凝集素家族基因，并对这个基因的结构与功能进行研究，阐明在现代分子遗 传育种中引入该基因的可能途径和重要意义。通过构建杀虫融合蛋白基因， 即将两个抗虫基因编码序列通过接头连接在一起，构成可同时表达两种抗虫 活性的融合蛋白，以期能延缓昆虫抗性的发生，而且也增强了杀虫活性。另 外，在减少基因沉默的措施上，在目的基因的两侧增加基质结合序列(MARs)， 以增强基因的表达能力。本研究取得的主要结果如下： 1．利用同源克隆的方法从野苋菜Amaranthu$viridisL．中克隆到野苋 菜凝集素基因(Amaranthusviridi$aggl 的抗蚜分析表明，表达野苋菜凝集素的转基因烟草植株都不同程度地抑制了 好的抗蚜性。AVA基因是苋菜凝集素基因家族的新成员，是一个有应用前景的 新的抗虫基因。 序列。经转化烟草对GUS活性测定发现，两侧顺式重复连接MAR对外源基因 差异仍然比较明显。 获得抗蚜转化植株。含有AVA基因的白菜植株对桃蚜的群体发展有一定的抑 制作用，在接种12天后的平均抑制桃蚜密度达55．8X；在转基因抗性植株上 观察到有少量桃蚜若虫死亡的现象。无MAR的转基因植株平均桃蚜抑制率为 34．3％。但含MAR的转基因单株之间基因表达也仍存在一定的差异。从总体上 来说含有MAR的转基因白菜植株较不含MAR的转化植株对桃蚜具有更明显的 抑制作用，且抗性程度与AVA基因的表达量呈正相关。 I和野苋菜凝集素AVAc的抗虫特性，利 4．根据豇豆胰蛋白酶抑制剂CpT II 胚性愈伤组织为转化受体材料，建立了一个高效而又简便的农杆菌介导的甘 甘蔗中转化。 关键词：野苋菜凝集素基因豇豆胰蛋白酶抑制剂MAR序列白菜 甘蔗杀虫融合基因 ⅡI CLONI NGANDTRANSGEN、乜STUD、1÷S 1馘A馘RAKTHUSv|RU)lS AGGLUTINlNGENE ABSTRACT insects to have and Sap-sucking belongHomoptera,whichpiercingsucking andfeed the of mostofthem of mouthparts plants，and areserious upon sap pests andhorticultural and agricultural cropsincluding