鸭坦布苏病毒j2010株的分离鉴定及间接elisa监测方法的建立.pdf

II 摘要 2010 年春季，在我国中东部养鸭较密集地区的鸭群中发生了一种以蛋鸭采食量 减少、共济失调和产蛋量急剧下降甚至停产或死亡为主要特征的传染病。该病传播迅 速，很快蔓延至上海、安徽、江苏、山东、河北等全国大部分养鸭地区，给我国养鸭 业造成了严重的经济损失。确定该病的病原，建立其快速诊断方法具有重要意义。 首先，对江苏某种鸭场临床发病鸭进行病原分离和鉴定。取典型症状病鸭的组织 脏器匀浆过滤液尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，4～6天后鸡胚死亡，剖检可见胚体 水肿、充血，绒毛尿囊膜水肿增厚，脾脏、肾脏肿大，肝脏发黄，表面有坏死灶。收 集鸡胚毒，命名为JS2010分离株。对分离毒株进行血凝性、培养特性、致病性和PCR 检测，发现该毒株对鸡、鸭、鹅和猪的红细胞无凝集作用；病毒接种鸡胚成纤维细胞 CEF Vero RT-PCR （ ）和非洲绿猴肾细胞（ ）后不造成细胞病变， 检测病毒核酸呈阴性， 但可以在乳仓鼠肾细胞（BHK-21）中增殖并产生细胞病变；对鸡胚的半数致死量和 3.68 5.33 对BHK-21细胞的半数感染量分别为10 ELD /0.2mL和10 TCID /0.2mL，病毒感染 50 50 后病鸭的组织病理变化主要表现在肝细胞脂肪变性，肝小叶之间淋巴细胞增生，空肠 固有层细胞结构破坏严重，固有膜淋巴细胞浸润，部分上皮脱落，大肠严重出血，肠 腔内充满大量血细胞，肠壁出血点明显；以鸭坦布苏病毒特异性引物从鸡胚毒中PCR 扩增出862bp目的基因片段，测序结果显示与鸭坦布苏病毒BYD-1株的同源性高达 99%。综合分析鉴定结果，确定该分离毒株为鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus， DTMUV）。 其次，对DTMUV-JS2010 株进行全基因组测序分析。根据GenBank 中登录的 DTMUVBYD-1 JF312912 11 RT-PCR 株（ ）全基因组序列设计 对特异性引物，通过 方法对JS2010株的全基因进行分段克隆并测序。结果显示，该毒株全基因序列核苷 10990nt 10278nt JS2010 酸为 ，包含一个大小为 的完整的开放阅读框。序列分析表明， DTMUV 99.2% 99.6% E 株与 参考毒株的全基因组核苷酸同源性为 ～ 。针对囊膜蛋白 基因进行序列比对和系统进化树分析显示，JS2010 株与黄病毒属Ntaya 病毒群的 Tembusu 87.7% 99.5% JS804 病毒的核苷酸同源性为 ～ ，与 株处于同一进化分支上， 表明JS2010株为黄病毒属Ntaya 病毒群的Tembusu病毒。 然后，克隆表达JS2010株囊膜蛋白E基因，制备重组E蛋白，为建立间接ELISA 方法提供试验材料。应用基因重组技术构建重组表达质粒pET-32a-E，转化至E.coli Rosetta Ni-NTA E 进行大量诱导表达，进而使用 亲合层析柱纯化重组蛋白 。经 SDS和Western-blot分析，发现制备的重组蛋白浓度为0.58mg/mL，纯度达到 95%，保留天然蛋白的抗原性，满足免疫检测试剂的要求。 最后，建立基于重组E蛋白的间接