西维因单链抗体因克隆、表达及活性分析.pdfVIP

摘要 本研究从106．107个分泌西维因抗体的杂交瘤细胞中提取总对妊，反转录成 cDNA，利用兼并引物分别扩增出抗体轻链可变区(VI．)和重链可变区(VH)基因， 对其进行测序鉴定，确定其为小鼠抗体可变区片段，片段大小分别为324 bp和360bp。 根据基因序列重新设计特异性引物，重叠延伸PCR扩增出单链抗体(scFv)基因片段， 经测序鉴定，片段连接正确，长度为729 kDa，但是形成包涵 SDS．PAGE检测结果表明获得重组表达抗体，分子量大小约为33 体。采用透析法对包涵体进行复性，并对复性条件进行优化，结果显示最佳复性时间 为48h，最佳起始蛋白浓度为200“咖L，含有精氨酸的复性液效果最佳。利用亲和 ‘ 良好的亲和性和特异性。 为了获得活性更好的基因工程抗体，本研究还在表达载体和信号肽方面探索，期 望获得可溶性重组抗体。本研究重新设计引物，从构建成功的scFv巾ET30a质粒中重 ’ h，SDS．PAGE检测结果表 (DE3)，在20℃，不同口TG浓度下，进行诱导表达12 kDa，在此条件 明，0．05I姗01／LmTG浓度下有少量可溶性表达，分子量大小约为30 下，大量制备可溶性抗体，用亲和层析柱纯化后，直接竞争ELISA检测发现这一抗体 与复性抗体相比，在特异性和稳定性方面没有优势。 ．C 不同口TG浓度下进行诱导表达12h，SDS．PAGE检测菌体破碎后的上清液中没有可 溶性抗体的表达，重组蛋白形成了包涵体，分子量大小约为40kDa。． 关键词：西维因；单链抗体；克隆；表达；活性 ‘ABSTRACT vjariable of r9舀omlight(324bp)chaillsⅣL)柚dheaV)r(360 锄曲odygell懿wmcloned缸吼hybridoma也atsecrctiI培speci矗c碰bodya鲥nst we他clonedint0 and carbaryl VLand、，H llsiIlggen蹦她面me璐．The pGEM·T-E嬲y b鹊ed0n血e llsedto wefe sequellced．Specificprime岱SyntllesizcdsequeIlced血岬ents of729 scFV 锄pli丘edsill西ech咖删able缸鲫础(scFv)砌ch麟composed bp．，nle sut)clonedno and慨sf0咖edint0E ．waLs pET30a results砌icatedmatmerecombill锄t scF