系列逆转座子分标记的建立及其在柿属植物中的应用研究.pdf

系列逆转座子分子标记的建立及其在柿属植物中的应用研究 摘 要 我国是柿属植物的分布中心和原产中心之一，拥有丰富的种质资源。逆转座子 是真核生物基因组中的重要组成成分，其在决定植物基因组大小、结构、功能以及 及其进化中扮演重要角色。开发和应用逆转座子分子标记，可为我国柿属植物种质 座子分子标记技术体系并应用于柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析等方面，同时应 属特异性逆转座子分子标记在该属植物遗传分析中的性能，此外，对柿逆转座子引 物在它类果树物种及禾本科、茄科和蔷薇科已发表的逆转座子引物在果树类作物上 的通用性进行研究，并对一份特殊种质‘90．1．10’进行了鉴定。主要结果如下： 1．利用抑制PCR方法从‘罗田甜柿’(Diospyros 少有10个逆转座予家族得到扩增；其家族间序列普遍表现高度异质，发生不同程度 的碱基替换、插入或缺失突变，以及翻译成氨基酸后的终止密码子突变、氨基酸取 代和移框突变等；家族内部某些序列相似性极高，类反转录病毒中的准种居群；序 box’’、“TATAbox”以及受不同胁迫条件 列LTR区含有启动子的结构特征“CAAT terminal 2．基于其中15条RNaseH-LTR(Longrepeat)序列共设计26条逆转座 tract) 引物。为增加特异性，引物设计过程中充分考虑其较长长度和高Tm值：长度均在 物表现较好。 3．优化PCR反应体系各组分浓度、退火温度(Tm)和扩增程序的基础上建立 amplified amplified 50 mmol／L、dNTPs0．25mmol／L、 反应体系中，含1×Buffer、模板DNA ng、M92+2．0 引物O．40 DNA聚合酶1．0 5rain； I-tmol／L、Taq U，矿物油20此；PCR扩增程序：95。C 95C1 l min 2 min。 rain；56。C min，循环44次；72℃延伸8 ramp+O．6℃／s：72。C 4．建立柿属SSAP(Sequence．specificamplifiedpolymorphism，特异序列扩增多 态性)逆转座子分子标记技术体系，并对可能影响其扩增性能的几个重要因素和不 同逆转座子在柿属种质遗传关系研究中的特点进行分析比较。结果表明，所有逆转 座子都产生丰富的多态性，表明每个逆转座子都可单独用于SSAP分析；SSAP扩增 性能与逆转座子自身的特点、选择性扩增酶接头引物的种类、组成及排序相关；不 同逆转座子在28份试材中表现不同的转座特点。研究为进一步使用多逆转座子分子 标记，以获得较为全面的柿属种质起源进化信息和进行遗传多样性评价及种质鉴定 提供技术支持。 5．建立适合柿属植物的通用引物逆转座子ISTR(Inverse sequence．taggedrepeat， 反向序列标签重复)分子标记体系，与IRAP同时用于32份柿属基因型的多态性和 亲缘关系分析，并比较二者分析性能。结果表明，1RAP和ISTR均能很好的用于柿 属植物的遗传分析；球AP能区分供试所有基因型，包括芽变；ISTR不能区分‘富 有’和其芽变‘松本早生’，但可以区分其它所有基因型；IRAP与ISTR的聚类结 果基本一致，但在细节上存在差异；IRAP在种间及种下分析所得的所有参数值(平 均每次实验扩增总位点数、平均每次实验扩增多态位点数、多态位点百分率Pi、多