白菜WRKY转录因子cDNA片段的克隆及分析.pdfVIP

_______________________________________________________________________________ 白菜WRKY 转录因子 cDNA 片段的克隆及分析 1,2 1∗ 1 王彦华 侯喜林 史公军 1. 2. （ 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095； 河北农业大学园艺 学院，保定 071001） 摘要：根据 GenBank 中登录的拟南芥 WRKY 转录因子的保守序列设计引物，采用 RT-PCR 和 3’-RACE 方法，从 SA处理的不结球白菜抗病自交系苏州青中，获得了 473bp的 cDNA片断。 序列分析表明，该序列含有 WRKY转录因子共有的 WRKYGQK保守结构域，与拟南芥 AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为 83%，与拟南芥 AtWRKY60同源性为 72%，表明已经成功克隆了不结球 白菜 WRKY1 基因 3’末端 cDNA 序列，在 GenBank 中登录号为 AF518555。 关键词：不结球白菜；水杨酸；WRKY 转录因子；RT-PCR；RACE 1.引言 转录因子与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用，或与其它蛋白共 同作用激活或抑制目标基因的转录。WRKY 转录因子是一类含有 WRKY 等氨基酸的锌指蛋白， 到目前为止，仅在植物中被发现[1]。WRKY 蛋白含有一个或两个十分保守的 WRKY 区域，但在 保守域外基因间的同源性较低。研究表明，WRKY蛋白能与核心序列为(T)TGAC的 W 盒顺式元 件结合，而 W 盒存在于许多抗病基因的启动子中；而且，WRKY 蛋白能够被病原菌及水杨酸 [2,3] （SA）快速诱导，说明 WRKY 基因在植物抗病信号途径中具有重要作用 。从上个世纪九十 年代中期以来，这类基因已在拟南芥、欧芹、甘薯、马铃薯、烟草、水稻等植物中被克隆[4]， 但在芸薹属蔬菜上，未见报道。 本研究参照已发表的拟南芥 WRKY 转录因子基因序列设计简并引物，以 SA 处理后 4h 的 不结球白菜为实验材料，通过 RT-PCR 和快速扩增 cDNA 末端（Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE）方法获得不结球白菜 WRKY 转录因子3’末端 cDNA序列，为进一步克隆该转录 因子全长 cDNA 奠定基础。 2.材料与方法 1.1 植物材料 供试材料为不结球白菜抗病自交系苏州青，由南京农业大学白菜课题组提供。将白菜种 子播种于装有灭菌基质的穴盘中，在人工气候箱中按照光照 12h、黑暗 12h 光周期，20-25 ℃下培养。幼苗两片真叶时，用2mmol/L SA （用 KOH 调节pH 至 6.5 ）进行喷雾处理，处理 后 4h 提取叶片总 RNA。 1.2 总 RNA 的提取 采用 TRIZOL(MD Bio)法提取总 RNA ，利用RNase Free DNase Ⅰ(TaKaRa)除去总 RNA 本课题得到高等学校博士点科研基金 （编号：20030307021 ）资助 *通讯作者 Author for correspondence E-mail ：hxl@ _______________________________________________________________________________中国科技论文在线 中痕量DNA 的污染。通过 1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性。 1.3 RT-PCR RT 反应参照大连 TaKaRa 生物公司的 TaK