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原生质体融合技术的研究进展 主要内容 概述 一 前景及展望 四 原生质体融合的步骤和方法 二 微生物原生质体融合的应用 三 一、概述 原生质体：细胞内由原生质组成的各种结构统称为原生质体，包括细胞膜、细胞质(包括各种细胞器、细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部分,原生质体是由原生质特化而来。 植物细胞即细胞壁内的原生质部分；动物细胞就是原生质体。 一、概述 原生质体融合(protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。 原生质体融合：也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。 与常规杂交相比，原生质体融合具有的优势： 杂交频率较高 霉菌与放线菌的融合频率为10-3～10-1，细菌与酵母的融合频率亦达到10-3～10-6 受接合型或致育性的限制较小 任何一株都可能起受体或供体 ，有利于不同种属间微生物的杂交 重组体种类较多 遗传物质的传递更为完整 可获得性状优良的重组体 可提高育种效率 可采用产量性状较高的菌株作为融合亲株 不足之处： 原生质体融合后DNA交换和重组随机发生， 增加重组体分离筛选的难度。 二、原生质体融合的步骤和方法 原 生 质 体 融 合 步 骤 1、亲本及遗传标记的选择 根据融合的目的选择适宜的直接亲本。现在一般认为亲本应采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种优势。 作为原生质体融合的二亲本都应该有一定的遗传标记，便于重组体的检出。常用的遗传标记有：带隐性性状的营养缺陷、抗性标记、热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标记。 实际应用时究竟采用哪各遗传标记，可以根据试验目的确定。 2、原生质体制备 制 备 流 程 原生质体制备的影响因素 菌体种类 菌龄 酶的种类 酶的浓度 （mg/mL） 酶解 时间 (20min-7h) 酶解温度 （℃） (一般为35℃-37℃ 或45℃） PH 渗透压稳定剂 细菌 对数生长中后期 溶菌酶 lysozyme 0.1-0.2 glucuronidase 1%-2% lywallzyme 1.5% snailase 10-30 时间较短 28-37 7.5-8.5 一类是盐溶液系统，包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl2，浓度为0.3 ~ 1.0mol / L； 一类是糖溶液系统，包括蔗糖、甘露醇、山梨醇、木糖、纤维二糖、鼠李糖等 放线菌 裂解酶 溶菌酶 28-37 真菌 纤维素酶、酵母裂解酶、β-1,3葡聚糖酶、几丁质酶、蜗牛酶 时间较长 30-35 5.5 3、原生质体的再生 原生质体再生的影响因素 培养基 稳定剂 酶解浓度和时间 再生方式 原生质体密度 其他因素：菌龄、预培养、残存菌体等 4、原生质体融合 4、原生质体融合 4、原生质体融合 原 生 质 融 合 过 程 4、原生质体融合 原生质体融合的影响因素 菌体种类 融合剂PEG的相对分子量 融合剂PEG的浓度 融合时间 融合温度（℃） 融合菌株间的亲和力 无机离子 细菌 1500~6000 一般30% ~ 50% l ~ 60 min， 大多数情况下为l ~ l0 min 4 、20 某些远源关系的菌株融合后融合子重组染色体不稳定，容易发生分离现象 Ca2 + 、Mg2 + 促进融合，而K+ 、Na + 会显著降低融合率。 融合时， Ca2 + 0 . 0l mol / L、Mg2 + 0 . 02 mol / L最佳 放线菌 1000~6000 20 真菌 4000~6000 链霉菌：1000 30 5、融合体的检出与分离 融合体中除重组体外，还有异核体或部分结合子、杂合二倍体或杂合系，这些都会在平板上形成菌落，检出融合体的方法有多种，在育种工作中可根据实验目的和微生物的不同加以选择。 利用营养缺陷型标记选择融合体 利用抗药性选择融合体 利用灭活原生质体检出融合体 利用荧光染色法选择融合体 双亲对碳源利用不同而检出融合体 利用形态差异检出 三、微生物原生质体融合的应用 选育优良的菌种 原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良。 彭帮柱（2006）等以酿酒酵母1605和苹果酒酵母E2为亲本，通过原生质体融合，得到融合子8#菌株，具有产香能力和发酵能力均强于双亲的优点。 封晓霞等（2011）对生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的酿酒酵母（S.cerevisiae）菌株R1进行复合诱变和原生质体融合。实验采用酶解法获得出发菌株S.cerevisiae R1的单倍体菌株hR10，对其进行UV和DES复合诱变，所得菌株与出发菌株相比SAM产量提高