人细胞色素P450+2C19与CYPOR、CYPb5共表达模型的构建及其抑制剂筛选.pdfVIP

药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2012, 32( 12) — 1 — ★生物检定★ 人细胞色素 P450 2C19 与 CYPOR、CYPb5 共表达模型的构建及其抑制剂筛选 * 孔丽敏, 胡海红, 曾苏 ( 浙江大学药学院 药物分析与药物代谢实验室, 杭州 310058) 摘要 目的: 获得人细胞色素 P450 2C19( CYP2C19) 蛋 白重组酶, 用特征性底物表征重组酶活性, 并将该重组酶用于天然产物 CYP2C19 抑制剂的筛选 。方法: 构建含人 CYP2C19 基因的重组杆状病毒穿梭质粒, 使用 昆虫细胞 - 杆状病毒表达系统共表达 人 CYP2C19、细胞色素氧化还原酶( CYPOR) 和细胞色素 b5( CYPb5) ; 用蛋 白印迹分析( Western Blot) 鉴定重组酶的表达; 以奥 美拉唑为底物进行代谢孵育, HPLC 分析 鉴定酶 的活性; 并使用 该重组 蛋 白对 70 种 天然产物进 行抑制 能力的筛选 。结果: Western Blot 结果显示重组人 CYP2C19 蛋 白在 Sf9 细胞 中成功表达, 该重组酶代谢经典底物奥美拉唑的酶动力学参数分别为: 米 氏常数 K 为( 4. 99 ±0. 22) μmol ·L- 1 , 最大反应速率 V 为( 0. 2539 ±0. 0024) μmol ·min- 1 ·mg - 1 蛋 白, 表观清除率 CL m max int 值为 0. 0509 L ·min - 1 ·mg - 1 蛋 白。对 70 种天然产物的抑制筛选实验显示 白藜芦醇、大黄素、异土木香 内酯、莪术醇、薄荷脑、 鬼臼毒素、补骨脂素、五味子 甲素、五 味子 乙素、新狼毒素 B 等对人 CYP2C19 有 比较 明显的抑制能力。结论: 利用 昆虫细胞 - 杆状病毒表达系统, 可获得代谢活性 良好的重组人 CYP2C19 蛋 白, 该重组酶可进一步用于其他底物的 I 相代谢研究以及各种 抑制剂的筛选 。 关键词: 人 CYP2C19; 昆虫细胞 - 杆状病毒表达系统; 共表达; 活性鉴定; 奥美拉唑; 天然产物; 抑制剂 中图分类号: R9 17 文献标识码: A 文章编号: 0254 - 1793( 2012) 12 - 20 - 09 Co - expression model and inhibitor screening of * the human CYP2C19 with the CYPOR and CYPb5 * * KONG Li - min, HU Hai - hong, ZENG Su ( Department of Pharmaceutical A nalysis and Drug Metabolism, Coll ege of Pharmaceutical Science, Zhej iang University, Hangzhou 310058, China) Abstract