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白 细 胞 配 型 主讲：姚超峰 MHC是表达于脊椎动物有核细胞表面的一类高度多态、紧密链锁的基因群，因其编码的蛋白产物—主要组织相容性抗原在组织相容的决定中起主要作用而得名。 人的MHC称为人类白细胞抗原系统（HLA系统），是人类基因中最复杂、多态性最高的遗传体系。其主要功能为参与自我识别、调节免疫反应和对异体移植的排斥作用。 定位于人与动物某对染色体的特定区域，呈高度多态性。MHC编码产物即MHC分子或MHC抗原，其表达不同细胞表面，主要功能是参与抗原递呈、制约细胞间相互识别及诱导免疫应答。 “组织相容性抗原”：诱发移植排斥反应的抗原被称为移植抗原或组织相容性抗原，其中可诱导迅速而强烈排斥反应者称为主要组织相容性抗原。 1999年10月，HLA全基因组DNA序列被测定公布。 HLA系统位于人类第六染色体短臂，全长3600Kb，包括128个功能基因和96个假基因，等位基因超过500多个。HLA复合体代表一组密切链锁的基因群，所有基因均为共显性。HLA复合体分为3个区域，从着丝点一侧依次为Ⅱ类基因、Ⅲ类基因和Ⅰ类基因区域所在。 HLA可分为3类： Ⅰ类 HLA-A、HLA-B、HLA-C经典基因，HLA-E、HLA-G、HLA-F非经典基因 存在部位：Ⅰ类分子存在于几乎所有的有核细胞表面。 Ⅱ类 基因包括三个亚区：HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP。 存在部位：Ⅱ类分子主要存在于抗原递呈细胞如B细胞和巨噬细胞，树突状细胞和活化T细胞。 Ⅲ类 基因位于Ⅱ类和Ⅰ类基因之间，主要与补体有关的C4A、C4B、Bf、C2等基因以及21-羟化酶基因、肿瘤坏死因子基因、热休克蛋白基因、和转录基因B144、BAT1—T9、G1、G4、G6、G7、G8等。以可溶性形式存在于血浆中。 器官移植已成为当今临床医学治疗和拯救生命的重要手段。20世纪，全世界有近100万人接受器官移植。而人类白细胞抗原配型是影响器官移植存活率的重要因素之一，所以白细胞配型很重要，下面进行重点讨论。 HLA血清学分型采用微量补体依赖的细胞毒试验，其原理是HLA抗体与淋巴细胞表面的相应抗原结合后激活补体，导致细胞膜损伤，通透性增强，染料进入细胞，在倒置相差显微镜或倒置荧光显微镜下观察，着染的细胞为死亡细胞，视野下死亡细胞超过40%试验为阳性。如淋巴细胞膜上无相应的抗原，则不发生反应，为阴性，从而将HLA分型。 尽管血清学技术对Ⅰ类抗原分型结果有较高的准确性，但也存在好多限制，例如存在抗原交叉问题，无法获得所有特异性标准血清等，基本上已被淘汰。现在包括国际上的大医院都在用ssp法 （主要组织相容性抗原分子基因的专一序列引物）。 PCR-SSP方法的原理是编码各种HLA抗原表型的等位基因不尽相同, 均可用相应的序列特异性引物（sequence specific primer，SSP）进行扩增，通过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因特异片段，对扩增的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否出现特异性产物的电泳条带读取结果。操作步骤如下： 一 标本采集：EDTA抗凝静脉血5mL，如果白细胞过少可将标本离心取白细胞层。 二 核酸样本萃取:有现成的试剂盒。 三 核酸样本的定量：萃取的核酸样本必须溶解于灭菌水或其他适当的溶液中，且用分光光度计调至浓度于10-80ng/ul，不可将核酸样本溶于含有超过0.5mM螯化物如EDTA溶液中。核酸样本经萃取后立即进行测试，或保存在-20℃或更低温环境中超过1年以上。 四 聚合酶链锁反映： 1从冰箱中取出核酸样本及适量的Master缓冲液使其回复至室温（20-25℃）。 2待核酸样本及Master缓冲液完全溶解后用振荡器混合器混合均匀，于桌上型离心机短暂离心使所有液体沉降至管底。 3从冰箱中取出摩根人类主要组织相容性抗原分子ABDR-SSP分型试剂盘，并打开包装，每个分型试剂盘可供一个样本测试使用，拆封后未使用可存放于4℃。 4从冰箱中取出TaqDNA Polymerase（5u/ul）置于冰冻盒上。 5在第一试管内加入2uL蒸馏水或核酸稀释液当做阴性对照。 6加入6.5ul的TaqDNA Polymerase到Master缓冲液试管中，盖上盖子后，震荡混合均匀，于桌上型离心机离心使所有液体沉到管底。 7取出10ul的Master/TaqDNA Polymerase混合液至阴性对照组反应管中。 8加202ul核酸样本（10-80ng/ul）至Master缓冲液/TaqDNA Polymerase混合液中，盖上盖子，震荡混匀。 9将上述混合液分装至分型试剂盘除第一个位置（阴性对照组）外各试管中，没管加12ul，可使用连续加样枪进行操作，操作时注意防止各管间的交叉污染，且不可让枪头接触到管底的干燥引物部分。 10将分型试