限制性内切酶介玉米弯孢霉叶斑病病菌转化体系的建立.pdfVIP

r 丫II，芍b74Z 目录 中文摘要……………………………………………………………………：…．1 Abstract…………………………………………………………………………………．．：……………l ● 1．引 言………………………………………………………………………………………………．．3 1．1玉米弯孢霉叶斑病病情现状……………………………………………．3 1．2病原生物学特征…………………………………………………………．3 1．3弯孢菌黑色素致病基因的研究…………………………………………．5 1．4玉米弯孢霉叶斑病病菌遗传转化方法的研究途径……………………．7 1．4．1 1．4．4转座子标签技术(Transposontagging)…………………………9 1．4．7激光(Laser)诱导融合法………………………………………10 1．4．8限制性内切酶介导整合(REMI)突变…………………………11 1．4．9农杆菌介导突变(ATMT)……………………………………。15 8 1．5本研究目的和意义………………………………………………………l 2．材料与方法………………………………………………………………19 2．1材料………………………………………………………………………………………………19 2．1．1供试菌……………………………………………………………。19 2．1．2试剂和药品………………………………………………………．19 2．1．3仪器和设备………………………………………………………．20 2．1．4供试培养基………………………………………………………．．20 2．1．5溶液的配制………………………………………………………．20 2．2实验操作…………………………………………………………………21 2．2．1大肠杆菌感受态细胞的制备……………………………………．21 限制性内切酶介导玉米弯孢霉叶斑病病菌转化体系的建立 2．2．3质粒pUCATPH的线性化………………………………。………．22 2．2．4菌落生长抑制浓度的筛选………………………………………．23 ．2．2．5原生质体制备方法………………………………………………．．23 2．2．5．1菌体的培养……………………………………………………23 2．2．5．2酶浓度条件的选择……………………………………………23 2．2．5．3酶解时间对原生质体制备的影响o…………………………24 2．2．5．4原生质体制备及纯化…………………………………………24 2．2．5．5原生质体再生…………………………………………………．24 2．2．5．6稳渗剂对原生质体再生的影响………………………………．24 2．2．6 REMI转化及转化子潮霉素抗性的稳定性检测………。………24 2．2．6．1 REMI转化……………………………………………………………………．．24 2．2．6．2突变体的生物学性状观察……………………………………25 2．2．6．3突变菌株的分子生物学检测…………………………………26 2．2．7 Bml基因的克隆………………………………………：…………28 2．2。7．1引物的设计……………………………………………………28 2．2．7．2 PCR扩增产物的检测及回收……………．：…………………．28 2．2．7．3 PCR回收产物与T载体的连接……………………………．．28 2．2．7．4连接产物转化DH50【感受态细胞……………………………29 2．2．7．5转化子阳性克隆的筛选………………………………………29 2．2．7．6阳性克隆的测序……………………………………………