cad杂合肽基在毕赤酵母中的表达及活性的检测.pdf

王烈喜 l{卜dI火学!≯位论文 cAD杂合肽基因在毕赤酵母中的表达及活性检测 硕：I二生：王烈喜 导师：张文庆教授 摘 要 peptide)的一种，是 天蚕素(Cecropins)是昆虫抗菌肽(antibacterial 最早被发现的一类抗菌肽，由31～39个氨基酸残基组成，分子量约为4KDa左 右，等电点约为8．9～9．5，表现出较强的阳离子特征；不含半胱氨酸(Cys)，不 能形成分子内二硫桥，抗菌谱主要包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，对病毒、 肿瘤细胞、原虫、真菌也有一一定的抑制作用。而且耐高温，100。C加热仍能保持 一定的活性。 domestica)成熟肽CecropinA和惜古比天蚕 本研究根据家蝇(Musca (Hyalophora 运用生物学软件DNAStar对其轮状结构进行预测，结果显示cAD的N末端具有较强 的亲水性，C末端具有较强的疏水性，预钡UcAD具有较强的杀菌活性。通过选用毕 赤酵母偏爱密码子，合成TcAD的4个片断，两两重叠互补20个碱基，为便于纯 序列。克隆到毕赤酵母pPIC9表达载体上。构建了酵母分泌型表达载体pPIC9一cAD， 用SacI线性化后，电击法转化毕赤酵母(Pichia 5，经PCR鉴定目的基因己稳定 MM板和MD板进行表型筛选结果90％以上为His+Mut 整合到毕赤酵母基因组上。对PCR鉴定正确的阳性克隆用甲醇诱导表达后，经 表明cAD在信引j太a—factor的介导下，正确分泌到表达上清中。利用琼脂孔穴平 板扩散法，杀菌效价等方法测定其活性，结果证明cAD杂合肽基因在酵母中得到 表达，表达产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶藻弧菌、和非溶血性弧菌等具 有一定的活性。 关键词：抗菌肽 CecropincAD杂合肽Pichiapastoris __ij：烈喜 一IIl¨大学学位沦文 of ExpressioncecropinA—cecropinDhybridgene InPichia itsantibacterial pastorand activity Abstract Master Lie-xi candidate：Wang Supervisor：Professor ZhangWen—qing Abstract The areawellcharacterized cecropins ofantibacterial family peptides．Mature are basic1-39 cecropins 3 aminoacidresidue thatcanfoldintotwo highly peptides amoreflexible showa broad amphipathicu—helics，separatedby hinge．Theyvery of both and spectrum