最新第二章酶的分离工程.ppt

Protein and Enzyme Engineering蛋白质与酶工程 思考题： 思考题 7. 酶液制备的过程有哪些？ 8. 说明有机溶剂沉淀分离法的优缺点。 9. 酶的结晶方法有哪些？ 10. 分析说明酶分离纯化的应用 生物分离是从生物材料、微生物的发酵液、生物反应液或动植物细胞的培养液中分离并纯化有关产品（如具有药理活性作用的蛋白质等）的过程，又称为下游加工过程。 作业题 1.根据酶生物合成的模式及产酶动力学，设计发酵工艺条件，提出提高产酶量的措施，请举例说明。 2.说明为什么酶的分离纯化每步均要检测总蛋白、总活力、比活力、纯化倍数、回收率，总个流程中他们变化趋势如何？他们能代表纯化的目标（纯度、数量、速度、收率）吗？为什么？ 3.比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析 在原理、操作(装柱、过柱）及应用方面的异同点。 作业题 作业题 6.等密度梯度离心、层析聚焦与等电聚焦电泳有何异同？ 7.离子交换纤维素 为什么较离子交换树脂更常用于酶等大分子物质的分离？ 酶的分离纯化策略 一原则 二方法选择 三纯化策略 四纯见检定 应注意的问题： 酶分离纯化的一般步骤: 第一节 酶溶液的制备（前处理） 三、酶溶液的絮凝、净化与脱色 双水相萃取技术 双水相萃取技术((Two-aqueous phase extraction,简称ATPS)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相,由于被分离物在两相中分配不同,便可实现分离 几种典型的双水相萃取酶蛋白实例 四、酶溶液的浓缩 分离工程概念及步骤 分离与提纯 从生物反应器中排出的反应产物是一种混合物，里面除含有目的产品外，还含有未转化的基质、不能转化的物质、大量的水、微生物体及各种微量杂质。为了获得合格的生化产品，并且不浪费其他有用的物质，必须对需要的生化产品进行分离或提纯。这一过程称之为“下游加工”，这样可以使其他物质循环使用或再进行综合利用，既降低了成本又保护了环境。 分离工程概念及步骤 1．固体物质的去除 分离生化反应液的细胞或其他固体物质，是提取生化产品的重要一步。分离过程是基于它们的粒度、密度、溶解度和扩散度等的不同实现的，分离的粒度范围为0.3~10μm。为了提高分离效率要进行预处理，以促进细胞的絮凝。常用的去除固体的分离方法是过滤、离心分离、沉降及倾析等。 分离工程概念及步骤 2．初步分离 当从反应器出来的反应液除去了不需要的固体颗粒后，一般要进一步把溶液浓缩，以提高目的产品在溶液中的浓度。为了实现这一过程，可以使用蒸发、萃取、沉淀和膜分离等单元操作。如膜分离技术是一种新型的分离技术，近年来发展很快。它是用一种半透明的薄膜，使溶液中的某些组分通过，其他组分被阻止或截留，从而达到分离的目的。它包括反渗透法和超滤法。膜分离法不同于萃取和沉淀法那样，需要加入溶剂或盐类等其他物质，也不同于蒸发操作，需要加入热量，膜分离法只是根据物质粒度的大小这一几何特性的差异，来分离物质，因此产品的损失很少，产率和质量较高。 分离工程概念及步骤 3．产品提纯 产品提纯的目的主要是去除溶液中的各种微量杂质，进一步提高产物的纯度。常用的方法有沉淀法、层析法和吸附法。但是生物产品的提纯，更多用的是层析法。层析法有吸附层析法、离子交换层析法、分子筛层析法和亲和层析法等，根据不同被分离物的特性，选择不同的层析分离方法。 分离工程概念及步骤 4．产品的最终分离 最后一步必须使产品达到规定的质量指标，以适合销售市场的要求。主要的单元操作是先离心分离，然后进行干燥或冷冻干燥等。干燥操作往往是生物产品的最后工序，其目的是除去物料中的水分，便于产品的保藏和运输。由于很多的生物产品，如味精、柠檬酸、酶制剂、抗生素及单细胞蛋白等均是固体产品，因此干燥操作在生物产品的最终分离方面十分重要。 我国在工业生物技术的上游领域（细胞工程、基因工程等领域）和世界先进水平差距较小，在某些方面甚至处于领先水平，但在工业生物技术的过程科学基础研究方面与国外有较大的差距，尤其是过程放大原理和方法。我国生物技术新产品的转化能力差，缺少有自主知识产权的产品中试、放大技术平台，不能迅速把实验室成果转化为工业产品，致使我国许多工业生物过程与发达国家相比普遍存在能耗高、资源综合利用率低、环境污染严重、产品质量差、工业放大周期长等问题，例如：我国较国外先进水平工业原料利用率低10-20％，产品回收率低5-15％，而能量消耗高20-30％，操作方式粗放，排污严重。至今我国的大型工业生物过程依然主要依赖国外技术。 第二节 酶分离纯化的基本过程 评价分离纯化方法优劣的3个指标 回收率：纯化后样品的总酶活占纯化前样品总酶活的百分比； 总活