最新第八章基因工程技术.ppt

　 　 第八章 基因工程技术 　　 ◆基因工程相关概念 ◆基因工程相关的酶学 ◆基因工程的载体 ◆目的基因的制备和分离方法 ◆载体与目的基因的连接 ◆重组体的鉴定与分析 ◆隆基因的表达 　 　 一、基因工程技术相关概念 　　（一）DNA克隆 克隆（clone）： 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化（cloning）： 获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。 分子克隆（DNA克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 　 　 基因工程： 　　 实现基因克隆所采用的方法及相关 的工作，又称为重组DNA技术 (recom-binant DNA technology)。 基因工程的基本过程和工作原理 在这个过程中： 1.“基因剪刀” 剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀” 2.“缝纫针” 连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起 3.“交通工具” 使用载体好比一辆车子 4.“乘客” 有用基因如IL2好比使乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK→抗癌）。 　 　 （二）工具酶 　　 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶I 逆转录酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 工具酶 一、 限制性核酸内切酶1.1 概念 识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切 割双链DNA的一类内切酶。 是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。 1. 限制性核酸内切酶 　 　 1.3基本特征： 限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。 限制性核酸内切酶作用后产生两种末端： 　 平头末端(flush end)和 粘性末端(sticky end) 　 　 　 　 粘性末端 　 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶 同裂酶（isoschizomer ），是来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。  同尾酶（isocaudarner），一类识别不同核苷酸序列但能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。同尾酶产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end），可用连接酶连接。如Sal I 与Xho I，BamH I与Bgl II。 限制性核酸内切酶 （1）消化作用：限制性内切酶以同源二聚体的形式与靶DNA序列发生作用识别，靶DNA的大小决定产生特定DNA片段的大小。 （2）片段化：单酶切：n(环状）或n+1（线性） 限制性核酸内切酶 双酶切：a+b(环状），a+b+1(线性） （1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：酶切位点太靠近时，先用一种酶切，然后再用另一种酶切 限制性核酸内切酶 （1）不同的DNA片段通过互补的粘性末端连接称为 分子间连接。 （2）同一片段的2个互补末端之间的连接称为 分子内连接 限制性核酸内切酶 (1) DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl等。 加大酶的用量，1μg DNA 用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间 限制性核酸内切酶 (2) DNA样品的甲基化程度：基因工程常常使用丢失了甲基化酶的大肠杆菌来制备质粒 大肠杆菌的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6 位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响。 大肠杆菌的dcm甲基化酶在5’ CCAGG 3’或5’ CCTGG 3’序 列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等 哺乳动物的甲基化酶在5’ CG 3’序列中的C5位上引入甲基。 限制性核酸内切酶 (3)底物DNA分子的构型：底物DNA不同构型对核酸限制性内切酶活性有较大的影响。 (4) 反应的温度：大多数为37℃ 限制性核酸内切酶 (5)反应体系的组成： 缓冲液的种类，pH值，高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、添加二巯基丙醇，二二硫苏糖醇（DTT），BSA DMSO等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。 EcoR I在正常