利用rna干扰乳腺生物反应器生产抗腹泻病转基因猪育种新材料的研究.pdf

摘要 仔猪腹泻是养猪业中常见的疾病，给世界养猪业造成了极大地经济损失。传统预 防和治疗猪腹泻的方法如改善环境、服食抗菌素和免疫接种等缺点日渐明显，存在很 多风险和问题，因此，迫切需要我们用新的方法和手段来有效控制这种疾病的发生。 随着分子生物学技术的快速发展，通过转基因操作改良性状的生物育种方法，直接针 对育种目标，目的性强、周期短，直接跨越基因互作的消极影响，可以同时改良多个 重要经济性状，这是一种新的富有生命力的疾病控制方法，具有传统的免疫学方法控 制疾病所无法比拟的优势。因此，利用转基因技术开展猪抗病育种研究，开发出具有 自主知识产权和抗腹泻病转基因猪抗病新品种，提高疾病控制水平，有效控制这种疾 病，意义重大。 本研究主要从两个方面入手创制转基因抗病育种新材料：一是通过RNAi技术， F18)的转基因猪生物育种新材料；二是通过乳腺生物反应 培育特殊抗病力(ETEC 器模型培育一般抗病力抗病转基因猪生物育种新材料。主要结果如下： 1．通过l斟Ai技术培育转基因猪育种新材料的工作如下： 1)建立了一种基于Cre．LoxP的多启动子介导多个sh砌妣的方法，获得了干扰，∽吖 的转基因囊胚； 2)建立了一种由慢病毒介导shRNA的方法，获得了7头转基因猪，并从其相关免疫 学指标及小肠粘附抑制等生物学功能进行了抗病性研究； 后F18大肠杆菌对小肠上皮细胞的粘附能力无显著差异，结合国内外研究，证明 了F明7不是F18大肠杆菌致病的主要受体基因； 2．通过乳腺生物反应器模型培育转基因猪育种新材料的工作如下： 1)为探讨转渺J『基因小鼠在疾病方面的抗病作用，利用小鼠可以在SPF这一环境 下饲养的这一优势，开展p必，在动物水平群体抗病性及上的功能研究，建立了 一种猪防御素．1(∥渺，)转基因小鼠模型，为建立大动物抗病育种模型奠定了基 础； 2)为了评估表达载体设计的合理性和高效性，为进一步开展利用乳腺生物反应器模 型培育一般抗病力的生物新品种奠定基础，建立了一种乳腺生物反应器载体验证 的细胞模型，同时通过细胞模型预测转基因成体动物相关免疫应答通路奠定了基 础及建立了研究模型； 3)建立了转入溶菌酶的转基因细胞系，并进行移植，获得了9头胎儿； 4)建立了转炒J『的转基因细胞系，并进行移植，获得了转基因囊胚。 本研究的创新点：首次建立了一种由4启动子介导4个sllImA的全部筛选标记可去 除的表达载体，并首次获得了干扰F硎的转基因囊胚；首次通过体细胞核移植获得 了慢病毒介导的IⅢA干扰的大动物模型；首次在细胞学水平上证明了F唧不是导致 仔猪腹泻与水肿病的主效受体基因；首次利用细胞模型对猪防御素进行了研究，初步 建立了一种乳腺生物反应器的细胞模型；首次获得了转炒珀勺转基因小鼠与转基因 猪囊胚。 关键词：猪， 腹泻，m蛆干扰， 乳腺生物反应器， 标记去除，猪防御素，人溶 菌酶，猪小肠上皮细胞，小鼠乳腺癌细胞 Ⅱ Abstract Thediarrheadiseaseleadst0tremendous economiclossesinthe worldwide． pigindustIy The仃aditionaland仃e咖entofSWinediarrhea preVention as the methods，such improving antibioticsand moreandmore 传edingenViroIlnlent，ta王(ing vaccination，are becoming and