山羊骨骼肌表达体pimau-egfp的构建.pdfVIP

摘 要 目前尚缺乏研究山羊肉品质基因的适宜模型，有关山羊肉分子机理的研究还相 对落后。鉴于转基因技术存在一系列潜在危险且改变基因组难度较大，本论文借鉴 人类基因治疗的理念和原理构建了适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体。 我们利用骨骼肌α-肌动蛋白的调控原件，肌肉钙粘蛋白 M-cadherin 的信号肽以及 EGFP 基因共同构建了可以直接在动物体肌肉细胞内异位表达并分泌 EGFP 的表达质 粒 pGEM-A5A3f-M-EGFP （pIMAU-EGFP）。该载体的构建为研究山羊肉肉品质基因奠 定了重要的基础。 本研究得出的结论如下： 1、成功获得本研究中的转录起始单元：骨骼肌α-肌动蛋白启动子 5’-侧翼区 核苷酸序列，大小为 2440bp 以及大小为 816bp 的携带Ploy (A)尾的骨骼肌α-肌动 蛋白启动子 3-’侧翼区核苷酸序列。通过测序验证，表明构建的表达载体中这部分 元件是正确可靠的，可以行使转录驱动功能。 2、根据 Genbank 登录号为：NM_007662 的参考序列，人工合成含有 63bp 的 M-cadherin 基因序列，限制性酶切位点，以及与 EGFP 基因有 20bp 重叠区的大引物 M-m-cadherin，利用重叠延伸 PCR 技术成功获得了本载体的核心基因 M-EGFP。 3、本研究成功构建了大小为 6967bp，以M-EGFP 为核心基因的骨骼肌特异表达 载体 pIMAU-EGFP，经测序验证其序列的正确性。M-cadherin 基因和 EGFP 基因之间 设计的双酶切位点用于后续与肉品质相关的候选基因的插入，为山羊肉质特征功能 研究奠定基础。 关键词：骨骼肌；M-钙粘蛋白；EGFP；组织特异性表达载体 Construction of the expression vector pIMAU-EGFP of goat skeletal muscle Abstract There is a lack of suitable model of goat meat quality genes, studies of goat molecular mechanism are relatively backward. In view of genetically modified technology, a series of problems about potential change genome is difficult and dangerous. In this paper, based on the principle of gene therapy, the goat skeletal muscle specific expression vector was constructed. Regulatory elements of alpha-actins for skeletal muscle, M-cadherin and the report gene (EGFP) were gotten together to construct the vector (pGEM-A5A3f-M-EGFP) that can directly express and secrete in the muscle cells of animals, which laid a foundation for improving gene function and gene expression. The results are as follows: 1. Transcription initiation unit in the success of this study: skeletal muscle alpha-actins protein promoter 5-flanking region nucleot