最新第四章++基因在大肠杆菌和酵母的高效表达.ppt

第四章 基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达 本章目录 4.1 基因的表达系统与表达策略 4.1.1 基因的表达系统 4.1.2 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略 4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达 4.2.1 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 4.2.2 蛋白质的融合表达 4.2.3 蛋白质的分泌型表达 4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性 4.3 基因在酵母中的高效表达 4.3.1 酵母表达系统概述 4.3.2 甲醇酵母表达系统 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达 第一节 基因的表达系统与表达策略 基因的表达系统 基因的高效表达策略 一、基因的表达系统 表达载体的组成： DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 及Amp, Tet抗性基因 目的基因转录的调控系统:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等. 蛋白质的翻译系统:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子. 表达系统的种类 原核表达系统 真核表达系统 酵母 植物拟南芥 昆虫 哺乳动物细胞系 一） 原核表达系统：细菌 二）真核表达系统 二、基因的高效表达策略 用于生物化学和分子生物学研究： 重点考虑如何保持蛋白质原有的功能 表达蛋白用作抗原：合成天然蛋白及表达融合蛋白的策略,考虑如何便于分离 用于蛋白质结构研究：形成可溶性蛋白质，保持结构完整 第二节 基因在大肠杆菌中的高效表达 大肠杆菌高效表达设计 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 蛋白质的融合表达 蛋白质的分泌型表达 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性 二、 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 优点： 1）T7噬菌体RNA聚合酶合成RNA的速度高于大肠杆菌5倍； 2）T7噬菌体RNA聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠杆菌DNA任何序列的转录； 3）T7噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有抗性； 4）T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统在一定条件下，基因表达产物可占细胞总蛋白的25％以上。 载体与受体系统 载体：pET表达系统（pET15，pET16，pET28，pET30，pET42等a/b/c三套，及pRSET） 大肠杆菌菌株：BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。(DE3)菌株基因组上以溶原形式携带一个克隆的T7RNA聚合酶基因，IPTG（异丙基硫代β－D－半乳糖苷）可诱导T7RNA聚合酶大量合成。 三、 蛋白质的融合表达 蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行表达。 在这种融合蛋白结构中，通常载体的担体蛋白部分位于N端，目的蛋白位于C端。 通过人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收目的蛋白。 四、 蛋白质的分泌型表达 是指周质蛋白、细胞内膜与外膜蛋白等以带有N端信号肽的前体形式首先在细胞质中合成，随后穿膜运送到周质或定位到内、外膜上的分泌过程。穿膜过程中，信号肽被信号肽酶切除。将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽的序列的下游可能实现分泌型表达。 分泌表达的优点： ①信号肽被切除后的蛋白质N末端的氨基酸序列与天然蛋白是一致的 ②周质空间中的蛋白酶活性比细胞质中的要低，从而使蛋白质较稳定地存在于周质中 ③周质中只有少量的细菌蛋白，使分离纯化更容易 ④周质空间存在一个氧化的环境，使得二硫键更容易形成 五 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。 六、 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 第三节 基因在酵母中的高效表达 酵母表达系统概述 甲醇酵母表达系统 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达 一 酵母表达系统概述 优点：克服大肠杆菌表达系统的不足，可以进行蛋白质翻译后的修饰合加工。 缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等。 二、 甲醇酵母表达系统 利用甲