大肠杆菌不耐热毒素对小鼠胚胎稳定性的影响及分子机制的研究.pdfVIP

!llllllipMUIIIIIHIII IIJ Y2143290 摘要 coliHeat．Labile 大肠杆菌不耐热肠毒素(Escherichia Escherichia coli，ETEC)分泌的能导致动物肠炎和腹泻的细 大肠杆菌(Enterotoxigenic 核糖基化酶的活性，B亚基能与真核细胞膜GMl神经节苷酯结合。LT除了具有很强 的细胞毒性外，还具有较强的免疫调节作用，可以刺激机体产生多种细胞因子，是 一种较强的粘膜免疫佐剂。研究发现由产毒大肠杆菌引起的腹泻常伴随妊娠动物的 流产，造成动物流产的原因除与内毒素(LPS)对胚胎稳定性影响外，可能还与其它 致病因子有关。根据动物胚胎稳定性依赖机体免疫平衡调节的原理和LT的免疫调 节及细胞毒性作用，推测大肠杆菌感染性流产可能与LT介导的免疫反应及细胞毒 性作用导致的胚胎稳定性下降有关。为弄清LT对动物胚胎稳定性的影响及其分子 机制，本实验利用大肠杆菌表达系统制备了重组LT蛋白(包括野生型LT和脱毒突 变体LTK63)，用重组LT处理妊娠小鼠、巨噬细胞和体外培养的2．细胞胚胎，分别 从LT免疫调节作用、激活炎性体作用和细胞毒性作用分析了LT对胚胎稳定性影响。 实验结果表明，利用大肠杆菌表达系统成功地制备了重组LTA和LTB及其突变 苷酯特异结合的活性。而LTA脱毒突变体LTK63，与预期一样缺乏细胞毒性作用。 由此可见制备的重组LT具有明显的生物活性。 为弄清LT对动物胚胎稳定性和子宫胎盘组织免疫调节的影响，用重组LT处理 妊娠小鼠。结果表明LT可明显降低小鼠胚胎存活率，明显提高小鼠子宫胎盘组织Thl 水平没有明显变化，可见LT能使Th淋巴细胞的细胞因子向着不利于胚胎稳定性的 Thl型细胞因子方向偏移。同时，LT可明显提高小鼠子宫胎盘组织IL．1p的含量， 表明LT可激活子宫胎盘组织巨噬细胞的炎性体，后者可激活细胞Caspasel，催化细 胞IL．1D前体的成熟和释放，进而促进子宫胎盘组织的炎性反应。组织免疫化学检测 结果显示，LT可明显降低子宫胎盘组织CD8+T淋巴细胞的数量，小幅提高CD4+T 淋巴细胞和巨噬细胞的数量。上述结果表明，LT通过破坏Thl／Th2免疫平衡和激活 巨噬细胞炎性体干扰胚胎的稳定性。 为进一步证实LT激活小鼠巨噬细胞的炎性体，我们用LT处理LPS致敏的小 鼠巨噬细胞系B6细胞，结果表明LT和脱毒突变体LTK63均可促进IL．1p的分泌， 表明LT引起子宫胎盘组织IL．1p含量增加与LT激活巨噬细胞炎性体有关。通过比 较LT不同亚基对炎性体的激活作用，证明只有A亚基能激活炎性体，而B亚基缺乏 激活炎性体的活性。 为探讨LT刺激小鼠巨噬细胞炎性体的信号传导途径，我们采用NALP3(炎性体 小鼠巨噬细胞系细胞，分析LT对炎性体的激活作用，结果显示用LT处理LPS致敏 的这两个细胞系，IL．1D分泌量均没有明显增加，说明LT激活巨噬细胞炎性体与 NLRP3／Caspase．1信号传导途径有关。 为了解LT细胞毒性对小鼠胚胎发育的影响，用LT处理体外培养的小鼠2．细胞 胚胎，结果最示：低浓度的LT对桑椹胚和囊胚的发育没有明显影响，但高浓度的 LT可使桑椹胚和囊胚发育提前。而LTK63对桑椹胚和囊胚的发育没有明显影响， 说明LT的细胞毒性作用可麓是影晌小鼠早期胚胎发育的重要因素。 综上所述，LT可明显降低胚胎稳定性，促进子宫胎盘组织Thl淋巴细胞因子的 表达，降低CD8+T淋巴细胞在子宫胎盘组织中的数量，使Thl／Th2细胞因子和 CD4+T／CD8+T淋巴细胞向不利于胚胎稳定性的方向偏移，LT可激活小鼠匦噬细胞炎 性体，促进子寓胎盘组织IL．1B的释放，引起组织的炎性反应，这些均为导致小鼠胚 胎稳定性下降的重要原因。 本项研究不仅丰富了大肠杆菌性流产致病机制的内容，同时为母畜大肠杆菌性流 产的防治提供了重要的实验依据。 关键词：大肠杆菌不耐热肠毒素；胚胎稳定性；细胞因子；炎性体；巨噬细胞