应用活体采卵-外受精技术生产牛性控胚胎的研究.pdfVIP

应用活体采卵一体外受精技术生产牛性控胚胎的研究 摘要 本研究探讨了牛活体采卵(OPU)和分离精子体外受精(IVF)的方法， 以提高牛0p沪王抨生产胚胎的效率。论文分为两部分：第一部分为文献综 述，包括第一和第二章；第二部分是试验研究，包括第三、第四和第五章。 第三章主要探讨优势卵泡、促性腺激素和用聚乙烯吡咯烷酮(PVp)溶 解促卵泡素(FS哟一次肌肉注射对牛0PU效果的影响，以确立OPU供体牛的 外源激素处理方法。试验l将8头供体奶牛随机分为4组，每组2头，分 ● 别按是否去除优势卵泡和是否注射FSH处理供体牛，FSH处理方法是连续注 射2d，每天2次，处理后72蠢应用B型超声波导引采卵，试验重复王0次。 试验2将去除优势卵泡的6头供体牛随机分为3组，每组2头，分别采用 孕马血清促性腺激素(PMSG)、FSH和对照处理供体牛，采卵方法同试验1。 试验3采用4x4拉丁方设计，将去优势卵泡的8头供体牛随机分为慈组， 和FSH分次注射(常规组)处理供体奶牛，采卵方法同上，并采血测定供体 牛注射FSH后不同时间的血清F铋含量变化，同时观察停止采卵后供体牛 的繁殖性能恢复情况。结果显示：(1)注射FSH前去除优势卵泡可显著提高 可采卵泡数、回收卵母细胞数和可用卵母细胞数(p0．05)，但不注射FSH 时去除优势卵泡与否效果无显著差异。(2)与注射P麓SG和对照组比较，采 30％PVP组和常规组体内血清FSH浓度变化趋势相似，可延长体内维持一定 巢造成一定损伤，但停止采卵2—3月后供体牛均能恢复正常发情，配种后 其受胎率(76．9％)与未活采奶牛受胎率(78．7％)比较无显著差异。 第四章主要探讨用外源激素(FSH、PMSG)处理供体牛后活体采集的卵 母细胞、屠宰牛卵巢采集的卵母细胞及其经体外不同保存时间后对IVF效 果影响。由于牛分离精子来源有限，故先选用未分离精子进行IVF试验， 为第五章用分离精子体外受精提供技术基础。本章包括三个试验，试验．1 分别将外源激素和无激素(对照组)处理供体牛后采集的卵母细胞进行 OPU—IVF囊胚分别移植给3头人工授精后受体奶牛。试验2、3采集来源干 屠宰黄牛卵巢的卵母细胞进行IVF，以比较离体卵巢抽取卵母细胞和活体 采集卵母细胞的IVF生产胚胎效果，并比较卵母细胞经不同时间体外保存 后对IVF效果影响。结果显示：(1)外源激素处理供体奶牛后活体采集卵 受精后的受体牛，结果有1头产双胎，其中1头犊牛来自OPU—IVF生产的 胚胎。(2)活体采集卵母细胞的IVF卵裂率、囊胚率和I、Ⅱ级囊胚率分 (3)卵母细胞体外保存3h后，其IVF卵裂率和囊胚率与对照组比较无显 降低(pO．05)。 第五章在牛未分离精子王垤的基础上，进行分离精子I垤试验。透过 探讨旋涡震荡法或微管吹打法除去受精卵卵丘细胞、两种分离精子IVF前 处理方法、早期胚胎培养液添加胰岛素和活体采集卵母细胞等对分离精子 王豫效果影响，以提高牛分离精子至￥F效率。试验卜4采集来源于屠宰牛卵 巢的卵母细胞进行体外成熟培养，随后分别与洗涤法或Perc011法处理的 牛分离精子、未分离精予进行IVF，受精后6—8h将假定受精卵分别用震荡 法或吹打法除去卵丘细胞，然后移入添加胰岛素的培养液与颗粒细胞单层 共培养，记录各组受精后48h卵裂数，7—8d囊胚数，并采用PCR技术测定 所产胚胎的性别准确率。试验5将活体采集卵母细胞与分离的X精子进行 王评，并将所产第?一8d的优质胚胎冷冻保存，以观察其解冻后复苏率，以 及将冻胚移植给5头经网期发情处理的受体牛妊娠效果。结果显示：(1)采 用震荡法或吹打法除去常规精予IVF的受精卵卵丘细胞，其卵裂率、囊胚 率无显著差异(p0。05)，但采用震荡法除去分离精子Z∽受精卵颗粒细胞， p p 液添加5 g触、10g／mL的胰岛素与对照组比较囊胚率和囊胚细胞数 虽精子活力和囊胚率与Percoll法比较无显著差异，但其活精子数显著提 所得囊胚的性别准确率分别是90．63％和86．67％。(5)性控胚胎可冷冻保存， 采集的卵母细胞与X精子I垤的卵裂率和囊胚率分别是46。15％、13。8S％， 且移植受体牛可妊娠。 可延长FSH在体内存留时间，提高活体采卵效果；(4)0PU对供体牛繁殖性 能无显著影响；(5)可用外源激素处理供体奶牛OPU—IVF生产胚胎，并经 胚